单细胞测序在表观遗传学中的应用

解螺旋 陪伴医生科研成长 1 单细胞测序在表观遗传学中的应用单细胞测序在表观遗传学中的应用 本综述由解螺旋学员 七七 负责修订（2018 年 10 月） 单细胞测序 （single cell sequencing） 是指先分离纯化单个细胞， 并提取该细胞的 DNA 或 RNA 进行扩增后测序的技术 1。该技术起步虽不太久，但已深受关注，被竞相用于研发和 生产、医用 2。相比于宏观组织样品的测序，单细胞测序对于细胞和组织的异质性具有更加 明确的分辩，当然，难度也相对更高。 由于在某些组织或研究领域（如癌症、干细胞池等） ，细胞处于显著的动态发展中，细 胞与细胞间差异巨大，而后续的显著变化（如成瘤、分化等） 、组织的异质性，却往往来源 于一个细胞克隆。从而，利用表观遗传学（epigenetics）这种非基因组核酸序列的功能差 异，对基因组 DNA 序列的物理修饰，关联和构象进行研究，将它们与表观遗传记忆，细胞特 性和组织特异性功能联系起来，来研究某一组织生理病理的变化就具有了极大的必要性 3。 此时，如果笼统考察组织块的表观遗传学改变，很容易模糊了幂律分布下细胞水平的差异 4；相反，结合单细胞测序方法，可用来捕获 DNA 甲基化，染色质可及性，组蛋白修饰，染 色体构象和复制动态以及非编码 RNA 修饰等， 这些技术正迅速成为细胞可塑性和多样性研究 的有力工具，可着眼于癌症、干细胞等早期的表观遗传学变化，对于理解病因、早期诊断、 晚期控制等方面具有极高的价值，为基因调控和疾病预后提供了有价值的见解 5。解螺旋 单细胞分辨率下表征表观基因组的实验方法的快速发展， 为更好地理解表观遗传机制及 其与基因调控的错综复杂的关系提供了有力工具。 在单细胞水平上， 表征和区分表观遗传动 力学是可行的 ； 虽然单细胞分析不能替代介入分析，但可以与其结合以区分间接相关与直接 相关 ； 此外在单细胞水平上表征和区分表观遗传维持和重编程的动态也是可行的，单细胞表 观基因组还可用于定义功能亚群和微环境， 而不仅仅着眼于表观遗传调控本身， 例如在研究 肿瘤病理学及干细胞时， 当 RNA 不能容易地和快速地提取或当转录所研究的细胞的转录状态 不稳定或过于动态， 基因组学和转录组学可能无法为手头的问题提供明确的答案时， 单细胞 表观基因组可能提供最佳的方法来研究种群内的单细胞， 用来从全基因组水平全面且无偏倚 的表征肿瘤病理学或干细胞微环境 6,7。 尽管分离纯化单细胞难度较高， 而且 DNA 的表观遗传修饰很难通过传统的聚合酶进行扩 解螺旋 陪伴医生科研成长 2 增（通常表观遗传学测序方法包括 BS-seq 和 ChIP-seq） ，因此，单细胞测序在表观遗传学 分析上的应用在技术上极具挑战 8，例如用来表征稀有或异质性细胞类群的单细胞甲基化蓝 图的 Single-cell bisulfite sequencing，表征染色质转座酶可及性的高通量单细胞测序 Single-cell ATAC-seq，以及用来表征单染色体局部与整体物理性质变异的 single-cell Hi-C 测序的应用等，此外，最近的单细胞组学与复杂的计算方法相结合，可以对复杂细胞 群体细胞变异的解卷积进行精确的定量测量， 这就使得能够在胚胎发育的早期阶段对各种细 胞状态和轨迹进行详细的表征和监测 9。许多研究者已在关于单细胞测序在表观遗传学中的 应用方面做出了可喜的研究进展。解螺旋 例如，基于 BS-seq 的方法中，Guo 等利用一种 reduced representation bisulfite sequencing (scRRBS)方法，可在一个小鼠胚胎干细胞中的整个基因组范围内，灵敏地检测 高达 150 万个 CpG 位点，并用该方法进行了单细胞表观遗传测序 10。再如，基于 ChIP-seq 的方法中，Assaf Rotem 等结合微流控和 DNA 特征码技术进行了数千个单细胞测序，观察了 单细胞水平上传统转录分析无法获取的表观遗传学异质性 11。此外，Kantlehner 等基于甲 基化敏感的内切酶的方法， 对肿瘤细胞进行了高通量单细胞测序， 分析了单细胞间感兴趣基 因的甲基化差异 12。最近一项研究，由 Christof Angermueller 等发表，更将此技术的应用 做出了巨大推进。他们在 61 个胚胎干细胞上，利用一种平行的单细胞全基因组甲基化测序 和转录组测序的联合技术，从全基因组水平分析了 DNA 甲基化异质性和转录异质性的关联 13。Christof Angermueller 参与的另一项研究，报告了一种基于卷积神经网络的计算方法 DeepCpG，其用途是建模低覆盖率的单细胞甲基化数据。将其应用于小鼠和人类细胞， 发现 DeepCpG 能准确预测缺失的甲基化状态， 并检测与甲基化水平和细胞间变异性相关的序 列基序 14。Darren A. Cusanovich 等利用大量的单细胞，分别进行单细胞测序观测了染色质 的可接近性，来阐释组织的异质性 15。Lorthongpanich 等利用单细胞测序甲基化分析，观 察了人类早期胚胎的表观遗传学嵌合现象， 并用以预测胚胎后期的生理缺陷， 该研究更进一 步为将单细胞表观遗传学测序用于孕产的临床诊断和治疗做了铺垫 16。 【解螺旋 】 Rattray M 使用 single-cell ATAC-seq 对细胞进行了分类及定义 17。 Jia J 使用 single-cell holo-seq 获得 32 个人肝细胞癌单细胞的小 RNA 和 mRNA 双转录组， 显示 这些细胞的全基因组超增强活性和肝肿瘤动力学 18。Leung YY 引入了新的单细胞小 RNA-seq， 即SPAR， 产生跨所有主要小RNA类型的高信息量小RNA注释和其他特征19。 Faridani OR 描述了应用于单细胞的 Small-seq，一种基于连接的方法，可以进行捕获复杂的小 RNA， 解螺旋 陪伴医生科研成长 3 包括 microRNA（miRNA） ，tRNA 片段和小核仁 RNA（snoRNA） ，用来研究小 RNA 参与的细胞过 程，包括剪接，RNA 修饰，mRNA 的降解，和平移停滞等过程 20。 以上研究表明，单细胞测序结合表观遗传视角的应用，已逐步向着更高的分辩能力、灵 敏度、和更多的维度迈进。相信在以肿瘤研究、干细胞研究为代表的前沿热门领域，单细胞 测序用于表观遗传学极具前景、并有丰富的进一步发展空间 21。 参考文献参考文献 【解螺旋 】 1. Levsky JM, Shenoy SM, Pezo RC, Singer RH. Single-cell gene expression profiling. Science 2002; 297(5582): 836-40. 2. Wen L, Tang F. Single-cell sequencing in stem cell biology. Genome biology 2016; 17: 71. 3. Stary CM, Patel HH, Roth DM. Epigenetics: The Epicenter for Future Anesthesia Research? 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