western blotting检测实验方法

解螺旋 陪伴医生科研成长 1 western blottingwestern blotting 检测实验检测实验方法方法 1.1. 实验原理实验原理 蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot，它是分子生物学、生物化学和免疫遗 传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物 组织样品进行着色， 通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织 中表达情况的信息。解螺旋 Southern 或 Northern 杂交方 法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质， “探针”是抗 体， “显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维 素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物 学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或 同位素标记的第二抗体起反应， 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基 因表达的蛋白成分。 2.2. 实验目的实验目的 获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 3.3. 实验实验材料材料 3.1.3.1. 主要试剂主要试剂（试剂来源仅供参考）（试剂来源仅供参考） 试剂试剂 来源来源 Cat.No.Cat.No. RIPA 碧云天 P0013C PMSF Bio-Rad MSB1001 Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225 4X Leammli 加样缓冲液 Bio-Rad 1610747 巯基乙醇 Sigma aldrich 60-24-2 Protein Marker 天能 180-6003 脱脂奶粉 生工 A600669 解螺旋 陪伴医生科研成长 2 Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientific 21059 ECL Western Blotting Substrate Thermo Scientific 32106 解螺旋 3.2.3.2. 主要仪器主要仪器 仪器名称仪器名称 来源来源 型号型号 离心机 Thermo Scientific Micro17R 恒温金属浴 佑宁仪器 MiniH-100L 酶标仪 BioTek Epoch-256600 电泳仪 上海天能 EPS-300 凝胶成像系统 上海天能 Tanon-600 3.3.3.3. 其他（请具体写明）其他（请具体写明） 蛋白 marker 需根据待检测蛋白分子的分子量选择合适的 marker。 4.4. 实验步骤实验步骤 （简略版本）（简略版本） 1. 提取组织或细胞蛋白； 2. 测定蛋白质浓度 ； 3. 电泳， 条件为： 恒压100V， 待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止 （约120min） ； 4. 电转膜仪转膜，条件为：恒流 250mA ，2h（时间可根据目的蛋白分子量适当调整） ； 5. 封闭：5%脱脂牛奶室温封闭 1h； 6. 加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇 1h 然后放入 4冰箱中过夜； 7. 收一抗，PBST 洗膜 3 次，10min/次； 8. 二抗孵育：室温孵育 1h，所用二抗的比例和种属可参见抗体产品说明书； 9. 洗膜：PBST 洗膜 2 次，PBS 洗膜一次，10min/次； 10. 显色。 （详细版本详细版本）解螺旋 解螺旋 陪伴医生科研成长 3 1. 组织总蛋白的提取 1） 大鼠/小鼠断头处死，冰浴上取出组织并称重，按照 80mg/ml 加入裂解液； 2） 冰浴超声匀浆，1520 sec； 3） 冰浴静置 30 min，离心 12000 rpm，4，20 min； 4） 取出上清液于新的 Eppendorf 管中， 留少量进行蛋白浓度测定， 其余转入-80 保存备 用。 2. 细胞总蛋白提取 解螺旋 1） 使用预冷的 HBSS 清洗细胞三次，吸干液体后，加入细胞裂解液裂解 1 分钟后使用移液 器将细胞吹打下来，装入离心管中，置于冰上； 2） 保持离心管在冰上站立约 15 min 后，于冷冻离心机中 14000rpm，4离心 20 min，离 心结束后取上清液，转移至另一洁净的离心管中； 3） 取出少量样品进行 BCA 蛋白浓度测定，其余样本放入-80 保存备用。 3. BCA 法测定蛋白质含量 1） 配制好 BCA 蛋白标准液； 2） 配制 BCA 工作反应液 A 和 B （A:B=50：1） ，96 空板中每孔加入 200ul 工作反应液； 3） 将待测蛋白样品和标准液分别加入到 96 空板各微孔中，每孔加入 25ul，于 37 杂交 箱中孵育 30 min； 4） 以紫外分光光度计测定波长 570 nm 的吸光值 A570，做出标准曲线； 5） 计算得到蛋白质样本的浓度； 6） 使用蛋白裂解液将各样本调整为均一浓度； 7） 加入蛋白上样缓冲液混匀并于 100 金属浴加热 10 min，冰上冷却后放置-80 冰箱 长期保存。 4. SDS-PAGE 凝胶电泳 1） 配制分离胶 12% gel 配制不同体积 SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积 （毫升） Total volume （ml） 5 10 15 20 30 50 解螺旋 陪伴医生科研成长 4 ddH2O 1.7 3.4 5.1 6.8 10.2 17 30%Acr-Bis(29:1) 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.0 4TrisCl/SDS, pH8.8 1.25 2.5 3.75 5 7.5 12.5 10% AP 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02 2） 配制 4%的浓缩胶 4% gel 配制不同体积 SDS-PAGE 浓缩胶所需各成分的体积（毫升） Total volume (ml) 2 3 4 6 8 10 ddH2O 1.21 1.82 2.43 3.63 4.84 6.06 30%Acr-Bis(29:1) 0.27 0.4 0.53 0.8 1.07 1.33 4TrisCl/SDS, pH6.8 0.5 0.75 1 1.5 2 2.5 10% AP 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1 TEMED 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.01 3） 插入梳子，室温聚合 30 min； 4） 拔出梳子，以 1SDS 电泳液冲洗加样孔； 5） 将凝胶板固定于电泳装置上的缓冲液室，放入下缓冲液室，同时向上、下缓冲液室加 入 1SDS 电泳缓冲液； 6） 待测样品（蛋白含量 30-50ug）充分混匀后上样，并在对照孔加入蛋白质分子量标准样 品； 7） 接通电源，浓缩胶 70V 电泳，分离胶 100V 电泳分离蛋白质； 8） 关闭电源，取下凝胶，去除浓缩胶，置于转移液中以备蛋白质检测。 解螺旋 5. 转移槽转印蛋白质到 PVDF 膜 1） 去除浓缩胶，在分离胶左上角切角做标记，用直尺测量其面积大小，将胶在转膜液中 平衡 15 min； 2） 剪裁 2 张滤纸，稍大于凝胶，用转膜液饱和； 3） 将 PVDF 膜切至比凝胶略大，用甲醇预湿，然后再转膜液中浸泡 25 min； 解螺旋 陪伴医生科研成长 5 4） 按照从阴极到阳极：Scotch-Brite 垫-滤纸-凝胶-PVDF 膜-滤纸-ScotheBrite 垫的顺 序制作转印三明治，并确保 PVDF 膜与凝胶之间无气泡； 5） 将转印夹层放入转移槽中，并加入预冷的转膜液，按照正确的极性方向江转移槽放入 电转仪中，连接电源； 6） 在冰浴条件下 260mA 电转 2 h； 7） 关闭电源，去除 PVDF 膜，进行蛋白质免疫检测，并将凝胶安全处置，丢弃与危险试剂 垃圾桶内。 6. 蛋白质免疫检测 1） 将 PVDF 膜放入封闭液中（含 5 %脱脂牛奶的 TBST） ，室温封闭 2 h； 2） 将 PVDF 膜用 TBST 简单冲洗后放入用封闭液稀释的一抗中，4 轻摇过夜； 3） 将 PVDF 膜从稀释过的一抗中取出，用 TBST 洗膜 315 min； 4）将 PVDF 膜放入用 TBST 稀释的种属匹配的 HRP 标记的二抗中，室温轻摇孵育 2 h； 1） 将 PVDF 膜用 TBST 洗膜 315 min； 6）使用 ECL 发光液，借助 LAS-4000 mini 型发光成像分析仪检测结果。