色谱柱的维护保养.ppt

HPLC色谱柱的认识和维护,1,2,3,4,HPLC色谱柱维护保养概要: 收到新的色谱柱 管路和接头 流动相注意事项 色谱柱的保护 保护柱 色谱柱的清洗 色谱柱的保存,HPLC色谱柱的维护保养,5,核实色谱柱的信息 是你订购的色谱柱吗? 规格是否正确? 固定相是否正确? 检查物理性损坏 用标准测试样品在标准条件下测试柱子，以验证柱效 每支菲罗门色谱柱都经过单独检测,收到新的色谱柱,6,色谱性能取决于整个系统，而不仅仅是色谱柱 管路和接头会造成系统的死体积 系统死体积会导致: 峰展宽 峰形差 柱效降低 灵敏度降低,管路和接头,7,优化HPLC系统以获得最大性能 改变连接管路的内径（id） 0.17 mm id到0.12 mm id 减小流通池的体积 标准流通池 13 L, 10 mm 路径 半微量流通池 5 L, 6 mm 路径 条件 Luna 3m C18(2), 10 x 2.0 mm (MercuryMS柱芯) 50:50 乙腈/水 ，0.2 mL/min HP1100 w/二元泵,管路和接头,8,优化前 峰宽 峰3: 0.072 min 峰4: 0.085 min 峰5: 0.103 min 分辨率 3/4 = 2.06 分辨率 4/5 = 1.89,优化前,优化后,优化后 峰宽 峰3: 0.057 min 峰4: 0.076 min 峰5: 0.099 min 分辨率 3/4 = 2.73 分辨率 4/5 = 2.35,管路和接头,9,泵到进样器 可以使用大一点的内径(0.010” = 0.254 mm) 进样器到色谱柱 管路内径最小化 通常使用0.007” (0.178 mm)或0.005” (0.127 mm) ID 色谱柱到检测器 管路内径最小化 大一些的内径会影响分离效果 通常使用0.007”或0.005” ID 检测器到废液瓶 可以使用更大的内径(0.010”),连接管路,10,11,并非所有的色谱柱和接头都一样 使用锥箍的种类/形状也各有不同 固定长度不同 (0.080”到0.130”) 固定长度很关键 管路一定要与色谱柱相匹配 不匹配的接头会导致死体积的增大或漏液 手紧接头 (聚合物的) 容易使用 一体的 符合柱头的形状,接头,12,聚合物 手紧螺母,接头,32圈螺纹/英寸 10号或0.190,锥箍,螺母,1/16OD管路 （0.010ID）,尖端固定长度 为关键尺寸,1/4OD标准分析柱 （250 x 4.6mm ID）,13,不同厂商的接头,14,如果超出锥箍的管路长度过长，锥箍将固定不当，导致漏液,如果超出锥箍的管路长度过短，就会造成死体积，导致峰展宽和拖尾,连接接头,15,彻底冲洗HPLC泵和管路以去除气泡（打开冲洗阀来加速过程） 连接色谱柱和进样器 检查流向是否与色谱柱标签指示方向一致 流动相起始流速为0.1 mL/min，随后逐渐增大到正常流速 停止流速并将色谱柱与检测器入口连接 重启流速，用10-30个柱体积的流动相平衡色谱柱 含有离子对的流动相平衡所需时间更长,流动相,16,使用HPLC级溶剂 使用最高纯度的化学药品和试剂 使用前脱气和过滤所有流动相 保证溶剂是互溶的 验证缓冲盐在混合水/有机流动相中的溶解度 （尤其采用从高水相到高有机相的梯度洗脱时） 检查样品在流动相中的溶解度,流动相,17,流动相,强烈建议每天更换水相缓冲溶液，以最大程度的减少微生物的生长，避免这些微生物堵塞在线过滤器和色谱柱。,微生物在柱头填料上的生长,18,保持pH在2.0到8.0之间（旧型硅胶和极性封尾相）或在1.5到10.0之间（新型硅胶） 低pH会使键合相从硅胶上断裂下来（水解） 高pH会使硅胶溶解 如在接近pH极限下运行时，使用预饱和柱将使这些影响降到最低 更新型的介质可以提供更宽的pH稳定性(1 12),其它注意事项,19,背压通常保持在3500 psi以下（常规的HPLC柱和系统） UHPLC柱具有更高的压力限（9000 psi） 流速必须符合色谱柱的背压限 避免突然的压力变化 万一背压升高，可以反冲色谱柱（向色谱柱制造商核实一下）,其它注意事项,20,2019/10/26,21,为什么要这么做呢? 最大限度地延长色谱柱的寿命 减少系统损耗 从长远来看，可以节约时间和成本 获得最佳的结果 怎样去做? 流动相入口过滤头 在线过滤器 保护柱 流动相脱气 过滤所有流动相组分 过滤所有样品,色谱柱的保护,22,样品基质是HPLC/UHPLC柱主要的污染物来源，常会导致: 背压升高 色谱性能降低 峰形问题（分叉，拖尾） 柱效降低 分辨率降低,样品作为污染物的来源,23,在向HPLC/UHPLC柱进样前，去除潜在的污染物 过滤样品(0.45或0.2 m针式滤头) 样品净化 例如SPE, 蛋白沉淀等,样品的制备,柱头处 新柱,柱头处 样品前处理不当,污染物,放大20000倍,放大20000倍,24,优点 通过去除颗粒和强保留的样品组分来保护昂贵的分析色谱柱 延长分析色谱柱的使用寿命 保持高柱效 节约成本 缺点 额外的管路和接头给系统增大了死体积 峰展变宽 保留时间变化,保护柱,25,一种通用的保护柱系统 直接连接减少死体积 100%的惰性和生物相容性流路 PEEK（聚醚醚酮） 钛 专利设计 操作简易 物美价廉 通用的柱芯,Security Guard,26,Security Guard,色谱柱,进样器,生物相容性钛管 （尖端）,保护柱芯,PEEK手紧螺母 （提供的）,PEEK锥箍,具有生物相容性和惰性流路的保护柱套,金属螺母,或,27,Security Guard,进样器,HPLC柱,柱芯-能很容易的检查污染物,生物相容性流路-对金属敏感型样品更好,通用的手紧连接至HPLC柱-无需扳手,污染物 要分析的化合物,28,保护使免受有害化学污染物和微粒的伤害 不会改变色谱图 操作简易 兼容几乎所有UHPLC、核-壳和亚-2 m柱，2.0到4.6 mm ID 压力到20,000 psi (1,378 bar),Security Guard Ultra,29,延长色谱柱寿命,不使用保护柱,背压,进样针数,更换柱芯,更换柱芯,使用SecurityGuard ULTRA,使用保护柱,不使用保护柱,30,色谱柱的维护保养,你愿意如何选择?,（每个柱芯）,你愿意将微粒、系统颗粒和细菌污染物截留在哪里呢？,31,咨询色谱柱制造商获取推荐的清洗程序和限制条件 采用不带缓冲盐的流动相冲洗色谱柱以去除缓冲盐 采用10倍柱体积的互溶溶剂冲洗，如甲醇或乙腈 采用20倍柱体积的强溶剂（THF或IPA）以去除强吸附样品组分 颠倒程序并用流动相平衡,色谱柱的清洗,32,色谱柱保存条件影响色谱柱的使用寿命 从不用缓冲盐保存色谱柱（长期保存） 采用10倍柱体积且不带缓冲盐的流动相冲洗以除去缓冲盐 对硅胶基质色谱柱一些典型的溶剂保存条件 反相: 65/35 乙腈/水 正相: 异丙醇或己烷 离子交换: 甲醇 SEC或二醇: 0.05% NaN3水溶液或10%甲醇,色谱柱的保存,33,保护您昂贵的分析色谱柱 延长柱寿命 保证最佳的色谱柱性能 保证质量分析结果 最大程度降低故障时间 节约成本 保护您的HPLC系统 最大程度减少系统故障 保证质量结果 节约成本,色谱柱的维护保养总结,34,保护柱 来自于活塞密封圈和进样阀转子的颗粒物，如不被除去将堵塞色谱柱 0.2 m针式滤头 使用亚- 2 m的色谱柱时，每个样品必须通过0.2 m的多孔滤膜过滤 流动相过滤 缓冲盐必须每日配制，并通过0.2 m的多孔滤膜过滤 在线过滤器 强烈建议在自动进样器和保护柱之间使用0.2 m的多孔在线过滤器,LC/GC杂志 11月1期, 2010 UHPLC技巧与技术 By John W. Dolan,“色谱保健”,35,固定相,填料本身有全多孔（luna等)与核壳(kinetex等)两种 键合相有C18，C8，PFP，Hilic等多种 合理选择固定相，对HPLC的分析结果影响很大,36,37,HMX RDX 1,3,5-Trinitrobenzene 1,3-Dinitrobenzene Nitrobenzene 2,4,6-Trinitrotoluene 2,4-Dinitrotoluene,3,1,5,4,6,2,7,Kinetex 2.6 m PFP 100 x 4.6 mm,Kinetex 2.6 m C18 100 x 4.6 mm,Nitroaromatics,38,Acquity BEH 1.7 m C18 50 x 2.1 mm,Kinetex 2.6 m PFP 50 x 2.1 mm,Phenolic Isomers,o-Methylacetophenone p-Methylacetophenone m-Methylacetophenone,1,2,3,Acquity is a registered trademark of Waters Corporation. BEH is a trademark of Waters Corporation. Phenomenex is in no way affiliated with Waters Corporation.,Complementary Selectivity,39,alpha-Ketoglutaric acid Pyroglutamic acid Glutamic acid GABA,无保留与分离,Kinetex 2.6 m C18 50 x 2.1 mm,Kinetex 2.6 m HILIC 50 x 2.1 mm,Isocratic 97:3 5 mM Ammonium formate pH 3.2 / Methanol,Isocratic 92.5:2.5:5 Acetonitrile / Water / 100 mM Ammonium formate pH 3.2,好的保留与分离,Toxicology Neurotransmitters Retention of Highly Polar Compounds,40,Epinephrine Norepinephrine,Little retention (under 30 sec),Kinetex 2.6 m C18 50 x 2.1mm,Kinetex 2.6 m HILIC 50