血红蛋白电泳的意义和判断(高级版).ppt

adult and newborn hemoglobin screening with capillarys,2,目的,血红蛋白结构和功能的回顾 sebia capillarys 2 / minicap血红蛋白检测说明 血红蛋白临床结果说明,3,血红蛋白的结构,血红蛋白分子是由4条多肽链(2对)和4个可以结合铁和氧气的血红素.,normal hemoglobins, contain alpha, beta, delta, and gamma globin chains.,三维结构,4 亚单位 2 alpha链 2 alpha genes 3 非 alpha链 : beta, delta, gamma 1 b gene , 1 d gene , 2 g genes,正常结果,hb a: a2b2,hb f: a2g2,hb a2:a2d2,+,-,琼脂糖凝胶 hydrasys (sebia) 碱性缓冲液,成人,新生儿,血红蛋白遗传病类型(hemoglobinopathies) ?,血红蛋白疾病 血红蛋白性质变化 : 血红蛋白分子病 结构异常, 一个或数个氨基酸变异或缺失, 都将会导致血红蛋白分子的电性发生改变 常见血红蛋白变异体 b-globin : s c dpunjab e 血红蛋白含量变化 : 地中海贫血 合成或合成调控异常 : b globin b thalassemias a globin a thalassemias 合并型 : 血红蛋白分子病hemoglobinopathies /地贫 thalassemias,血红蛋白遗传病,遗传性疾病基因学图谱,正常基因,异常基因,异常血红蛋白类型,目前, 已经证实的有超过1000 种以上的变异体(a, b, g and d) 大部分变异体出现频率较低, 并且没有明显临床症状 4种主要变异体 (hb s, hb c, hb e and hb dpunjab)出现频率较高 ( 特定人群) 携带者会出现健康问题 儿童可能在出生时即伴随有严重症状,血红蛋白疾病的区域分布图,thalassemias,常见与地中海区域: 意大利, 西班牙,希腊, 近东地区, 非洲北部. 同样常见于东南亚 : 泰国,印度, 越南,中国, 印尼. 临床症状 * beta 地贫重症型 - 严重贫血 (需要长期输血治疗) * beta 地贫中间型 * beta 地贫轻微型 - 无临床症状,beta 地中海贫血,常见区域,bo 没有beta链合成 b+ 合成能力下降,alpha 地中海贫血,临床症状: 根据alpha基因的表达状态, 有4个不同程度的alpha地贫症状 * 1 个基因表达沉默: 静止型 (非常难检测到, 在出生会测到hb barts 1-2% ) * 2 个基因表达沉默: 轻型alpha地贫,在出生会测到barts 2-10% * 3 个基因表达沉默: 血红蛋白hb h病, 出生时出现2-30% barts, 儿童-成人出现 10-15% hb h * 4 个基因表达沉默: hb barts胎儿水肿综合征 (死胎),常见区域 常见与远东地区,非洲和地中海区国家,镰刀型红细胞血症,变异体出现在 6 gag (谷氨酸) gtg (缬氨酸),c型血红蛋白分子病,变异体位置:aa 6: gag (谷氨酸) aag (lys),htrozygote composite,ac,sc,chromosomes 16,a2,a1,a2,a1,homozygote,chromosomes 11,htrozygote,d,b,d,b,a,g,a,g,g,g,g,g,d,b,d,b,a,g,a,g,g,g,g,g,chromosomes 16,a2,a1,a2,a1,sc heterozygote compound,chromosomes 11,heterozygote,d,b,d,b,a,g,a,g,g,g,g,g,d,b,d,b,a,g,a,g,g,g,g,g,d型血红蛋白分子病,常见区域: 常见于印度.,特点: 变异体位置 b121 glu (谷氨酸,负电荷) gln (谷氨酰胺, 不带电荷) (d- los angeles = d-punjab) (6 different hb d according to the position of the mutation) 碱性缓冲液中: 电荷下降 m电泳速度变度变慢,靠近hb s,临床症状:,基因杂合体: 无症状 (仅在电泳中发现d区带) hb a fraction: 65 70 % hb d fraction: 30 35 %,基因纯合体: 轻微贫血 hb a fraction: absence hb d fraction: 100 %,e型血红蛋白分子病,常见区域: 常见与东南亚地区.,特点: 变异位点 b26 glu (谷氨酸,负电荷) lys (赖氨酸,正电荷) 碱性缓冲液: 总体带电荷下降 凝胶电泳中,出现在hbc附近,临床症状:,杂合体: 无症状 hb a fraction: 65 70 % hb e fraction: 30 35 %,基因纯合体: 轻微贫血 hb a fraction: absence hb e fraction: 100 %,下列情况下,需要进行血红蛋白检测,临床和遗传问题 (产前诊断) 贫血,小红细胞症 新生儿筛查 对来自地贫高发区人口,进行筛查 对诊断有帮助的其他信息 患者临床症状,年龄,籍贯和其他相关的背景 (输血记录) 血液全套检测, 网状细胞级别和进行细胞形态镜检 hb电泳 (edta抗凝管) 离子平衡和溶血情况,血红蛋白检测的几种方法,目前, 血红蛋白检测步骤如下: - 电泳法对hb进行检测 或者使用等电聚焦电泳法 - 使用 hplc法进行确认.,20,凝胶电泳结果识别表,21,在ph梯度的凝胶片上, 根据蛋白不同的等电点,对蛋白进行分离 hb电泳位置取决于缓冲液ph值 蛋白电泳至其等电点位置后,停止泳动 at pi=ph, hb does not have a net charge and stops migrating 电泳分离效果好, 但时间长.需要经验丰富才能获得良好结果及进行结果判断,等电聚焦电泳法,介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法: - 通过毛细管电泳法, 即可以获得与ief方法一样的分辨率,同时检测结果量值hb a2/hb f同样精确. - 出现异常变异体后: 使用下列方法确认: * itano test (solubility test) * hplc液相色谱 * genotyping基因筛查,capillarys 2,minicap,全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测 capillarys 2 / minicap,毛细管电泳法原理,此时,电渗力(eof)远远强于电场力. 因此,蛋白被动从正极向负极端移动.,正电极 +,eof,负电极 -,electro migration,蛋白电泳,detection,injection,capillarys/minicap血红蛋白电泳,血红蛋白条带,在电渗力的作用下,8分钟即完成电泳过程, 然后,在415nm紫外光下被检测并显示出来. 正常质控品 必须在每天检测前使用 capillarys : - 检测速度: 40 样品/小时 试管架1 至 7号位放置样品, 8号位放 4ml溶血素 minicap : - 检测速度: 10 样品/小时 试管架1 至 26号位放置样品, 27号位放溶血素(8个样品消耗5ml溶血素),capillarys/minicap血红蛋白检测标本要求,抗凝管采血 (edta, heparin, citrate). 如果需要对输血患者采血, 需要在输血前采集血液. 使用去除血浆后的红细胞(隔夜或5000 rpm,5分钟离心后样品) + 4c以上, 标本最多存放7天. 需要长期存放, 可以洗涤红细胞后,放置于 -80c (可存放至少 3个月),capillarys minicap 血红蛋白条带识别表,capillarys/minicap区带识别表,z 15 : hb h z 14 : / z 13 : hb-j rovigo, hb n-baltimore, j-kaoshiung z 12 : hb barts, hb providence, hb j-mexico, hb j-baltimore. z 11 : hb kaoshiung(new york),denaturated hb a z 10 : hb hope, hb m-iwate z 9 : hb a, hb camperdown, hb phnom penh z 8 : acetylated hb f, hb altanta, hb athens-ga z 7 : hb f, denaturated hb s, hb porto-allegre z 6 : hb d-punjab, hb philadelphia, hb korle-bu, hb lepore, hb kln,denaturated hb e. z 5 : hb s, hb hasharon, hb handsworth, denaturated hb o-arab. z 4 : hb e, denaturated hb c, hb kln, hb a2 variants, m-iwate hb a2 variants z 3 : hb a2, hb o-arab z 2 : hb c, hb constant spring, setif hba2 variant z 1 : hb da2 hb aa2, hasharon hb a2 variant, winnipeg hb a2 variant,30,正常hb a2 质控品,条带结果可录为qc,31,hb afsc质控品, 可用来作为参照曲线, 便于异常结果的判断,32,hbs a, f,a2 检测结果可通过颜色进行区分,异常区带显示为灰色,主要异常血红蛋白变异体,z15 hb h z12 hb bart z10 hb hope z9 hb a z7 hb f z6 hb d punjab z5 hb s z4 hb e z3 hb a2 z2 hb c,hbe,hbs,hbh,34,hbs 变异体, hb a2 正常值 6 glu val,hb a = 22,hb s = 2s2,hb a2 = 22,capillarys/minicap血红蛋白试剂优势:,无需前处理(不需要洗血和溶血)，直接检测 血红蛋白c和e能从a2分离开 根据s型和d型的细微电荷区别, 进行区分. 对于处于a和s之间的f给予个性化和聚焦的精确量化. 对a2型血红蛋白有很好的分辨率和分离效果 hb barts 和 hb h可以很好的检测和量化 糖化型血红蛋白电泳出现在主体峰内,不影响检测结果,36,异常结果分析,37,case 2: 31 y female, 血红蛋白 12.8, 红细胞压积 37.4 (i),a = 84.1 % f = 1.5% a2= 5.5%,38,31 y female, hgb 12.8, hematocrit 37.4 (ii),alk,acid,f,s,c,a2,c,s,f,-thalassemia- 轻型,a2,a,a,a,a,c,p,c,p,a=93.4%, f=1.1%, a2=5.5%,hb a 92.5% hb f 2.6 hb a2 4.9%,hb f,hb a,hb a2,67 y female from tunisia, hgb 9.1, hematocrit 28, mcv 62,小红细胞症; beta thalassemia轻型,hb h 4% hb a 94.7% hb a2 1.3%,hb a,hb a2,hb h,child 9 y, from laos, hgb 8, hematocrit 27.9, mcv 54.1,严重小红细胞症; 血红蛋白h病，需要基因筛查,41,hb h and barts - alpha-thalassemia,h barts,42,case 1: 13 y male, hgb 8.1, hct 24.0 (i),a2= 6.1% s = 82.8 %,43,case 1:13 y male, hgb 8.1, hematocrit 24.0 (ii),alk,acid,f,s,c,s,a2 + f,c,s,f,s,hgb f/s, a2=4.6% + beta thalassemia minor,a2,a,f,a,c,p,c,p,44,case 2: 65 y male, hgb 9.4, hematocrit 27.3 (i),co-migration with a2,a= 62.1 % a2 = 31.7%*,45,case 2: hb e migrates separately from hb a2 26 glulys,21y, pregnant woman,hgb 13.1, hematocrit 38.6,hb a 95% hb f 2.1% hb a2 2.9%,normal pattern, hb f slightly increased (pregnancy),baby 2 months old,father from martinique, mother from central africa, hgb 11, hematocrit 29.8,hb f 49.5% hb s 25.9% hb a2 1.8% hb c 22.8%,hb f,hb s,hb a2,hb c,sc compound heterozygoty,diabetic patient, 54 y, hgb 14.5, hematocrit 43.5, mcv 88,hba1c measurement (hplc tosoh),hb a 54.7% hb x 41.7% hb a2 3.6%,hb a,hb a2,hb x,normal hemogram; compatible with heterozygote a/d; to be identified by genotyping,hb a 51.8% hb a2 2.9% hb c 35.9%,hb a,hb a2,hb c,diabetic patient, 61 y, hgb 11.6, hematocrit 34.8, mcv 85,slight anemia; compatible with heterozygote a/c to be identified by genotyping,adopted child, 4 y, originated from haiti, hgb 10.9, hematocrit 31.3, mcv 76.9,hb a 97.5% hb a2 1.4% hb x 1.1%,hb a,hb a2,hb x,slight anemia; heterozygous delta mutation, asymptomatic,diabetic patient, 73 y, hgb 10.2, hematocrit 30.8, mcv 87.3,alpha chain mutation; genotyping confirmation: hb winnipeg a 75 asp tyr,hb a- wi,hb a2-wi,hb a,hb a2,hb a 90.3% hb f 3.8% hb a2 5.9%,hb a,hb f,hb a2,hb a 64% hb s 33.1% hb a2 2.9%,hb a,hb s,hb a2,hb a 2.2% hb f 67.3% hb s 29.1% hb a2 1.4%,hb a,hb f,hb s,hb a2,father: beta thalassemia minor mother: heterozygote as,baby 2 months old: association s - beta thalassemia,hb lepore on minicap/capillarys,n,ac.,a0 + lepore,a1,hb a2,hb a,hb f,hb lepore,afsc control overlaying,hb lepore,b和d链重新组合形成. 在碱性缓冲液下电泳: 总体带电荷下降 电泳位置出现 在s型血红蛋白附近,基因杂合体: hb lepore fraction: 5 15 % clinical signs of minor b thalassemia,基因纯合体: hb lepore fraction: about 30 % clinical signs of homozygous b thalassemia,常见区域: lepore (- boston washington): 常见于意大利人群; 同样常见于在罗马尼亚, 澳大利亚和墨西哥人群. 特点:,a47 asphis,hb hasharon,hb a,hb a2,hb f,hb hasharon,hb ha-a2,hb o-arab,b121 glulys,hb a2+ o-arab,hb f,hb a,diagnostic flow-chart,a new fast hemoglobin electrophoresis method for dried blood spots on sebia capillarys automated system,现有的新生儿血红蛋白筛查方法 (scd),新生儿血红蛋白检测: * 等电聚焦 (ief) * 高效离子交换液相色谱法 (ce-hplc). 毛细管电泳方法可取代常规,操作复杂的等电聚焦方法,新生儿血红蛋白快速检测法,取血板,bsd600 全自动打孔器,全自动溶血, 样品稀释和检测,条码识别： 取血板条码样品稀释杯条码,使用纯净水洗脱样品,与ief方法比较, 毛细管方法优势,对于常见异常血红蛋白变异体有100区分能力 (hb s, c, d, e) 对其他非常见变异体有良好检测能力 对不同类型样品拥有相同检测能力：新生儿, 早产儿或者进行过输血患儿样品 全程检测溯源性: 取血板和样品稀释杯使用条码 高效性(48个样品/小时), 576样品/天 4小时人机分离操作, 最多可进行3x192个样品检测 可选择使用与毛细管匹配的全自动打孔机, 完全自动化处理样品 无需人工进行样品转移, 避免交叉污染 该项目检测完全自动化: 从前处理到检测, 直到结果分析,全程无需人工干预.,使用标准取血板, 在室温下进行干燥. 干燥的取血板可在 2-8c下,保存1个月.,新生儿血红蛋白检测的样品要求,通过颜色区分正常及异常样品,正常血样 : with hb f and hb a (+ acetylated hb f),异常血样,提供样品检测完整溯源性,通过样品 id, 试剂杯和全自动打孔器的数据记录完成数据交换,异常样品自动显示,电泳图谱说明 : * 检测到条带的位置, 图谱会自动定位 * 鼠标经过的区带位置, 会显示出该区带的所有可能出现的异常血红蛋白名称. (n1 to n13).,新生儿血红蛋白检测条带名称识别表,n 13 : hb barts n 12 : / n 11 : hb hope, gamma chain variants, denatured hb a n 10 : hb a n 9 : denatured hb f n 8 : / n 7 : hb f n 6 : / n 5 : hb d-punjab, hb g-philadelphia, hb korle-bu n 4 : hb s, acetylated gamma chain variants n 3 : hb e, hb f-ouled rabah, gamma chain variants, methemoglobin n 2 : hb a2, hb o-arab, hb f-ouled rabah, gamma chain variants n 1 : hb c,正常血样,birth: 19/01/06 sample collection: 24/01/06 term : 39 w. weight : 3445 g,输血后检测结果,birth: 29/01/06 sample collection: 01/02/06 term : 38 w. weight : 3100 g,f/s homozygote,birth: 05/01/06 sample collection: 08/01/06 term : 37 w. weight : 3490 g,hb s,hb f,denatured hb f,早产儿体内的f/s,denatured hb f,hb f,hb s,birth: 20/02/06 sample collection: 23/02/06 term : 34 w. weight : 1300 g,f/sc compound heterozygote,denatured hb f,hb f,hb s,hb c,birth: 30/01/06 sample collection: 02/02/06 term : 40 w. weight : 3900 g,f/as heterozygote,hb a,hb f,hb s,birth: 16/12/06 sample collection: 19/12/06 term : 36 w. weight : 2780g,f/c homozygote,hb f,hb c,denatured hb f,birth: 20/12/05 sample collection: 24/12/05 term: 39 w. weight: 3160 g,f/ac heterozygote,birth: 18/12/06 sample collection: 21/12/06 term: 40 w. weight: 3035 g,f/ac in a premature newborn,birth: 17/10/05 sample collection: 20/10/05 term: 30 w. weight: 2330 g,f/ad heterozygote,birth: 29/01/06 sample collection: 31/01/06 term: 37 w. weight: 3280 g,f/e homozygote,hb e,hb f,denatured hb f,birth: 10/11/06 sample collection: 13/11/06 term: 40