电泳技术专题教学讲座PPT.ppt

,电 泳 技 术,琼脂糖凝胶电泳技术,实验室常用琼脂糖有常熔点和低熔点两种类型。 低熔点(lmp)可用于dna片段的回收。由于其凝胶中无抑制酶 ，可在凝胶中进行酶切、连接。,dna电泳影响因素,1 dna分子大小 2 dna分子构型 一般，质粒dna分子超螺旋的最快、线状分子次之、开环分子最慢。 3 凝胶浓度 对于 小片段dna分子的分离采用高浓度的凝胶分离，对于大片段则用低浓度的凝胶。,dna电泳影响因素,4 电场强度 电场强度高，电泳速度快，但分辨率低。 5 eb 6 电场缓冲液 tae tris-乙酸 tbe tris-硼酸 tpe tris-磷酸,50tae buffer 配制方法,1. 称量tris 242g，na2edta.2h2o 37.2g 于1l烧杯中； 2. 向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀； 3. 加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解； 4. 加去离子水定容至1l后，室温保存。,10tbe buffer配制方法,1.称量tris 108g，na2edta.2h2o 7.44g，硼酸55g 于1l烧杯中； 2.加入约800ml去离子水，搅拌均匀； 3.加去离子水定容至1l，室温保存。,电泳示意图,仪器和试剂,仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等,1 电泳缓冲液 2 上样缓冲液,常用电泳缓冲液,作用： 增加样品比重，以确保dna均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,溴酚兰缓冲液 100ml 溴酚兰 0.25g 二甲苯青 0.25g 蔗糖 40g,上样缓冲液(1),6上样缓冲液 loading buffer 100ml 30mm edta 36%(v/v) 丙三醇 0.05% (w/v)溴酚蓝 ph7.0,上样缓冲液(2),溴化乙锭（eb） 是一种荧光染料，eb分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 1 称取1geb固体于专用容器中； 2 加入100ml的ddh2o，搅拌至溶解完； 3 转移至棕色瓶中，4避光保存。 注意事项：eb是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,核酸染色剂,dna分子量标准,操作步骤：,1 凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶 称取适量琼脂糖加入 20ml 0.5tbe，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 时，加入 eb 溶液。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。,2 加样 取10l dna样液与 2l 上样 buffer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。,3 电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为15v/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。,观察拍照,聚丙烯酰胺凝胶电泳,45%的聚丙烯酰胺1000ml 丙烯酰胺 434g 甲叉双丙烯酰胺 16g 加600mlddh2o在37溶解，最后定容到1000ml.,9%的聚丙烯酰胺凝胶150ml 45%的聚丙烯酰胺 30ml 20tbe 7.5ml ddh2o 48ml 尿素 63g 以上在37溶解，然后预冷到4，再加入1.6%ap(过硫酸铵)5ml和temed(四甲基乙二胺)75ul。,0.2%的银染液500ml 取硝酸银1.0g加超纯水充分溶解，然后定容到500ml,避光、低温保存备用。 显影液400ml naoh 2g 四硼酸钠 0.08g 甲醛 1.6ml,聚丙烯酰胺电泳基本步骤：,(1) 首先用自来水沾上洗涤剂把两块玻璃板擦洗干净，然后用蒸馏水冲洗，干燥后用无水乙醇仔细擦洗一遍，待酒精完全挥发后就可以制胶板。,聚丙烯酰胺电泳基本步骤：,(2) 将两块玻璃板固定在电泳槽中，通过调整旁边的螺母使玻璃板受力均匀，向电泳槽中倒入少量的缓冲液检查是否漏液。,(3) 取50ml的9%变性聚丙烯酰胺胶液，用针筒将胶液缓缓注入两个玻璃板的夹层中，然后从灌胶口将梳子轻轻插入到合适位置，用吹风机吹热风以加速其凝固，在其凝固过程中，注意补充胶液。,(4) 将电泳槽装配好后，向槽中灌0.5xtbe，用吸水纸将电极擦干，以防止电泳时短路，恒电压350v预电泳30min.,(5) 将梳子小心拔出后就可以点样，每孔点样15l。恒电压450v电泳34h至二甲苯青为胶板的2/3处，在电泳过程中要确保胶板温度不高于50以免玻璃板破裂。,(6) 电泳结束后，先将缓冲液倒出，再将玻璃板从电泳槽取下。然后小心地将胶板移入去离子水中，轻摇漂洗两次，每次1min。,(7) 倒入0.2%的agno3进行银染15min，然后用去离子水轻摇漂洗两次，每次1min。 (8) 用显影