有机溶剂对细胞的毒害及细胞的耐受性机制.doc

文库下载 免费文档下载/本文档下载自文库下载网，内容可能不完整，您可以点击以下网址继续阅读或下载：/doc/32b960d333d4b14e85246836.html有机溶剂对细胞的毒害及细胞的耐受性机制溶剂毒性分析（】年（）微生物学通报问区（驿证叫喇）由于没有特定功能和进化速率比大多倍，近几年来在细菌鉴定和分类方面倍受关注。通过对核酸序列库中个种的个一弓序列进行比较发现，它们没有高度保守区域，同源性最高的是编码的基因。利用多拷贝的的一的长度和数目的差异可以鉴别不同属、种及型的细菌。技术和测序技术结合，又发展了直接测序方法，更使序列分析在细菌系统发育应用更加深入。已有资料表明不同属、种之间生物体的亲缘关系越远，州核苷酸序列差异越大，例如上等以序列分析黄单胞菌属内不同种之间的序列相似性达，经聚类分析将划分的个基因种分成个簇，其中簇由舶血舶彻、邶沁梳、妇洳缸、“个种组成，甘蔗黄单胞菌（如矗）则形成独特的谱系类群，簇则以油菜黄单胞菌为核心，其余的个种组成”。参考文献岬，】册且，汕州姆，：邱劳，伏建民，金德敏，等生物多样性，（）：劬【：是少息，张成刚，张忠泽微：物学杂志，（）：【】曲咿，址捌“呻?叫啊，伽，盯：一。嘴，哪（：眦幻山盯，嘶盯：（】【啊，：舂连，章琦，周永力，等中国水稻科学，（）：呻啦，曙州籼叫丑盯/doc/32b960d333d4b14e85246836.html，哪，蒯曲脚，啦：捷撅泉，刘秀梅微物学通报，勰（）：龇啪，叫“，“雌，“，（）：，有机溶剂对细胞的毒害及细胞的耐受性机制王庆利何丹郑晓冬梅乐和抗州（浙江大学食品科学系嘲）摘要：在非水相生物转化和涉及有机溶剂的环境微生物技术中，有机溶剂对微生物细胞的毒性使相关的研究和应用受到制约，这些有机分子进人到细胞膜中，破坏膜的完整性、增加膜的通透性，使细胞死；但在一些情况下，某些微生物町以通过自身的抗性机制在有机溶剂巾存活，而微生物对有机溶剂的耐受性主要取决于物理障碍、细胞膜水平、主动泵出系统个层次相应的隹理生化作用。关键词：细胞，有机溶剂耐受性中围分类号：文献标识码：文章编号：（）在非水相生物转化和涉及有机溶剂的环境生物技术中，许多过程都与有机溶剂和细胞或酶的相互作用有关。在完整细胞牛物转化过程中，有机溶剂对细胞的毒性则成嘲家自然科学基金资助项目（）州晰一面出咖蝴哪（哪彻）浙江省自拣科学基金资助项目（）收稿日期：叭艟抛，惨回日期：蚴邶埘微生物学通报年（）为有机相催化的重大障碍。然而，在科学研究中，也发现了许多对有机溶剂有抗性的微生物。年等“报道了脂酶在有机相中的活性，年，等”发现了一株可以在高浓度的甲苯存在下存活的假单孢菌，这两个发现改变了细胞和酶在有机介质中/doc/32b960d333d4b14e85246836.html不能存活和保持活力的观点，从而引起了人们对有机溶剂对细胞毒害机理和细胞耐受性研究的关注。有机溶剂对细胞的毒害作用，主要有两个方面，（）引起细胞的生物膜破坏，导至廷长抑制或者死亡；（）由于溶剂本身的自然毒性，破坏基础代谢，直接导致细胞的死亡。对于那些对有机溶剂有抗性的微生物来说，其耐受性机制也很复杂，包括细胞膜脂肪酸组成的改变”“。，细胞阻止溶剂进入的物理障碍，磷脂头部基团的改变”，溶剂的主动泵出系统等。在该领域中，假单孢杆菌对有机溶剂的耐受性研究比较多，本文将针对有机溶剂的毒性产生和细胞耐受性的机制作详细的论述。有机溶剂存在下的细胞生长自然界中，有机溶剂特别是芳香族化合物和一些毒性非常强的有机化合物，在生物的生长环境中含量非常低，对细胞的毒性非常大，没有给细胞造成生长压力或形成选择压力，因此从进化的角度看，细胞不能与这些有机溶剂协调共存；然而，在生命的起始阶段，环境中与水可互溶的低级醇或酸有可观的量存在，微生物对这些物质有一定的耐受性，亲脂性较强的某些物质，比如植物油，对细胞的毒害作用比较小。当然，大部分细胞对有机溶剂的耐受性比较差，可以在一定种类和剂量范围的有机溶剂环境中生长的菌株，所表现出来的生长特性与正常情况不大相同。恶臭假单胞菌（如“由大下降，）在甲苯、乙苯、正六烷、环六烷、乙醇中生长时，最大生长率降，生物量也大大下降“；处于对数期的细胞加入有机溶剂后，生长率也大和町”分离到耐受高浓度乙醇的菌株热介纤维梭菌（以玎！）和乙醇的存在下，生长延滞期明显变长，同时前者的最适生长温度也降低了。这些现象都是由于有机溶剂对细胞的毒害作用所引起的。://doc/32b960d333d4b14e85246836.htmlpar有机溶剂对微生物细胞的毒害机理有机溶剂对细胞毒害机理的研究还不是非常透彻，广泛接受的观点是有机溶剂对膜脂的影响，如有机溶剂会引起细胞膜通透性的增加，使细胞膜的基本功能丧失，膜蛋白酶失活，质子梯度破坏，运输系统崩溃，或者高浓度时直接使细胞裂解。也有人认为”，有机溶剂可以将磷脂从细胞膜中萃取出来，使参与基础代谢的辅助因子从细胞中泄漏出来，使细胞的生理活性丧失，下面所阐述的是被广泛接受的观点。有机溶剂对膜结构造成的影响多数人认为，溶剂在膜中的积累导致了对膜的破坏。一旦溶剂溶解于细胞膜中，就会破坏膜的完整性。等”监测了荧光标记过的溶剂在膜中扩散，发现嘏值介于之间的溶剂可以比较容易的进入膜中，导致膜面积的急剧增加，最大比例可达两分子膜脂分子：分子溶剂分子。等人”在研究有机溶剂对革兰氏阴性菌的影响时也观察到，有机溶剂存在时，细胞膜从片层的双层状态变成了蜂窝状。显然，有机分子的介入，破坏了细胞膜的完整性。有机溶剂在膜中的积累造成毒害从有机溶剂的深层次毒害机理来看，它在细胞膜中的浓度基本决定了毒性的大小，而有机溶剂在膜中的浓度与通过理值来度量的极性密切相关。在两相系统中，溶剂在膜中的实际浓度依赖于下面两个方面：（）溶舢年（）微生物学通报?剂在水相中的浓度，（）溶剂从水相到膜的分配。“等在研究报告中给出了一个有参考意义的公式，来描述不同极性的溶剂在膜中达到平衡时可能的浓度：，式中：嚷，”溶剂在细胞膜和水相中分配系数的对数值。嘴，”溶剂在辛醇和水相中的分配系数的对数值。利用这个公式，如果一种溶剂在水中的浓度已知，就可/doc/32b960d333d4b14e85246836.html以计算出它在膜中的实际浓度。等人的研究证实，甲苯、乙苯、环六烷引起尸如生物量降低的程度依赖于它们在膜中的实际浓度，而和它们的结构不相关。可以这样理解少量的溶剂分子进入细胞膜内，并不足以破坏整个细胞膜，只有当浓度达到一定的限度，使细胞膜的基础功能丧失，细胞才会死亡。实际上，不论何种溶剂，对于完整细胞都存在一个界限浓度（），在该浓度以上，细胞就会死亡。除了极性外，某些有机溶剂是由它们的化学特性所决定的，比如“在辛烯存在的情况下不能存活，但在同等嘏值（）的甲基环六烷存在下，却可以形成菌落。不同的细胞，培养环境及生长状况不同，受到有机溶剂的影响也不同。等”“证实，金属离子特别是二价离子可以增强细胞的抗性；细胞处于对数牛长期时，抗性比较强，而在稳定期，抗性会有所下降。总之，有机溶剂对细胞的毒害机理主要是大大增加了膜的通透性，破坏了它的完整性，毒性的大小具体和溶剂的性质以及细胞本身有关。细胞对有机溶剂的抗性机理研究发现，能在有机溶剂中存活下来的微生物细胞，可采取多种方式去适应这种不利的环境，这些机制主要包括有机溶剂进入细胞的物理障碍、细胞膜组成的改变以及有机溶剂泵出系统等。有机溶剂进入细胞的物理障碍细胞膜的存在，是细胞得以存活的根本条件之一，也是阻止有机溶剂分子进入细胞的第一道屏障。革兰氏阴性细菌的外膜由类脂多糖、肽聚糖层组成，它们紧密相连，并包围着细胞膜。有研究表明，类脂多糖的糖链越短，对有机溶剂的抗性越差，而类脂蛋白缺陷型菌株对有机溶剂则非常敏感；革兰氏阳性菌外膜的结构有所不同，作为物理屏障的效果没有革兰氏阴性菌好，正是这种差异，使得菌相对于一细菌耐受性差一些。蛋白（外膜蛋白）是保证细胞膜完整所必需的一种膜蛋白，”等”利用反义基因技术得到一株耐受性假单孢菌突变株，该菌株对甲苯等有机溶剂非常敏感，野/doc/32b960d333d4b14e85246836.html生型在甲苯浓度达时仍可存活，而突变株在浓度低于的情况下都不能生长。很显然，膜的不完整，使有机溶剂分子比较自由的进入细胞，从而产生毒性。细胞外膜（壁）和细胞膜是有机溶剂进入细胞的第一道屏障，它在细胞抗性的机制不是最重要的，但也是有机溶剂泵出系统发挥正常功能所必不可少的。细胞膜脂肪酸组成水平的抗性机理脂肪酸组成水平上的改变是细胞对有机溶剂产生抗性的最重要的机制。在该水平上，微生物主要通过“而增加也有一定的作用。帅机制（机制）和膜脂中脂肪酸的异构化来实现，磷脂酰头部的改变和膜中蛋白比例的微生物姒机制的抗性机理：机制最初从细胞对乙醇的反应中观察到，是微微生物学通报年（）生物通过调整膜中脂肪酸的饱和度和脂酰基的长度来维持膜原有流动性的一种机制，一般在生长过程中通过膜脂从头合成来改变膜脂组成，是细胞对有机溶剂抗性反应的最简单方式。“在乙醇的存在下，不饱和脂肪酸对饱和脂肪酸的比率明展增加使膜的流动性保持相对稳定；将“接种于有苯或辛醇存在的培养摹巾，也可观察到类似的现象；在培养基中添加饱和脂肪酸可以增加“对有机溶剂的抗性。另外”。也发现辛醇中生长的耐受性假单胞菌，其细胞膜中脂酰基链的长度明显比非耐受性菌株有所增加，在这个过程中，由幽编码的定位于内膜上的一个酶起了重要作用”。通过机制，微生物可以产生一定的抗性，但是，在有机溶剂存在的情况下，微生物往往通过另外一种独一无二的方式来实现对高浓度有机溶剂的抗性。脂肪酸的异构化：在微生物细胞膜中，顺式脂肪酸和反式脂肪酸有定的比例，在有机溶剂存在的情况下，耐受性菌可以非常迅速的改变两者的比例，对抗细胞膜通透性的增加，特/doc/32b960d333d4b14e85246836.html别是在微生物不支持脂肪酸从头合成的情况下，双键的异构化机制可以使它适应高浓度的有机溶剂。当添加有机溶剂培养巨大假单孢菌时，顺式脂肪酸可以迅速的转变为反式构象”。；“等”人也发现，辛醇存在时培养的假单胞菌，其细胞膜中原有的：环丙烷的含量戏剧性的迅速降为零，转变成六烷酸（：，），后者继而转变为一卜六烷酸；等在研究中也发现，耐血在芳香族化合物的存在下，细胞膜中反式脂肪酸大量增加，同时顺式脂肪酸的含量大量降低。机制是微生物耐受性研究巾最广泛的一个领域，它的机理在于顺式和反式脂肪酸的立体性不同，前者有弯曲的构型，与不饱和脂肪酸类似，赋予膜流动性；后者有一定的刚性，可以像饱和脂肪酸一样，插入到膜的内部，增加膜的非流动性。这种异构化不涉及双键的易位或转换，具有不依赖细胞生长、反应迅速、：需要能量输人等特点。浅蓝菌素（酰基载体蛋白合成酶的不可逆抑制剂）存在的情况下，细胞不能生长，但有机溶剂存在时，仍能观察到脂肪酸到脂肪酸的异构化；转化的发牛不受毒性化合物的浓度影响，但一的比率依赖于其浓度和亲脂性。该反应是由定位于细胞膜或胞外质的异构化酶所催化，该酶已经在中进行了表达。的异构化是对环境条件改变的迅速而有效的反应，不仅在增强微生物对有机溶剂耐受性中起重要的作用，在其他环境压力下比如重金属、高温、低等情况下也有这种现象，暗示着这种机制是细胞对胞膜通透性改变的一种广泛的适应机制。膜组成中与抗性有关的其他因素：除了上面所提到的以外，在膜水平上，磷脂极性头部基团的改变和膜中蛋白质比率的增加，也埘耐受性有一定的帮助。磷脂极性头部的改变/doc/32b960d333d4b14e85246836.html，结果往往是心磷脂（）的增加和脑磷脂（）的减少”“，通过对比性实验胁池在甲苯的存在下，心磷脂的含量从增加到，而脑磷脂则从降至；而且，随着有机溶剂值的降低，的肯量越高，的含量越低。另外，在含苯酚等有机溶剂的培养基上生长的细胞中，可以观察到膜中蛋白质比率比正常情况有所增加，有可能膜蛋白质使脂酰摹链的刚性增强，从而起到补偿膜增加的流动性的效果。主动的抗性机制有机溶剂泵出系统在上述机制发挥作用时，有机溶剂分子仍可大量进入细胞膜，针对这种情况，耐受性微生物通过依赖能量的运输系统，将溶剂分子从膜中泵出，保证其处于致使细胞死亡的特定浓度（面“）年（）以。微生物学通报”利用一株耐受型假单孢菌突变株（耐受性减弱）和野生菌进行耐受性对比实验，以气态形势通人，一“一二三氯甲烷时，虽然突变株仍保留有膜水平适应变化的能力，但在膜中有机分子的浓度是野生型的倍；”通过监测“标记的有意的是，有机溶剂耐受性菌株也往往表现出对抗生素有一定的抗性，比如四环素、尼日利亚菌素、氧哌嗪青霉索、氯霉素等。通过基因分析发现“，这个系统中个基因编码的氨基酸序列和家族（，（）（）中依赖质子的多约物泵系统中的蛋白质非常相似。主动运出系统要起作用，一方面，必需要求具备有机溶剂分子的扩散阻碍，前面所提到的膜物理障碍就是保证它有效发挥作用的基础；另一方面，需要能量的输入，这一点与依赖的多药物泵出系统（一）也完全相同，在实验中也观察到，当/doc/32b960d333d4b14e85246836.html能量被限制时，细胞由于不能有效的阻止有机化合物分子在膜中的积累，数最急剧下降。到目前为止，这种模型的建立很大一部分依赖的是两亲性分子的实验，而且由于缺乏可靠的底物泵出测量手段，其具体机制和作用情况还不足很清楚，关于它的基因水乎、蛋白质水平分析和作用机理等都需进一步作深入的研究。展望溶剂耐受性菌株有两个非常重要的廊用领域，非水相完整细胞生物转化和环境生物技术，通过研究有机溶剂对细胞的毒性及微生物耐受性机制，可以拓展这两方面的应用。虽然本文总结和提出了一些观点，但是抗性作为一种总的表现，所涉及的生理生化反应非常繁多和复杂，而且不同的微生物针对不同的有机化合物可能有所不同，这些都需要进一步研究。参考文献吐，：一删血。吕，粥：阻嘶锄抽，山衄出，耐卵蚀曲啊镜山倒，：勰，一（蛐洲酣测。盯，：“，孵，“耐叫日睁删”叫，拢（】：叽，肿，蠡删蛐曲唧，：一】明【，仃，邮盹。盯“艄一研，坫（）：嘣，聒“口，卸，嘶：/doc/32b960d333d4b14e85246836.html。帆啪，删删，出。妇，册胁删玎目，蚪：，肿咖盯。哪“叮，卯：啦唧哪唧留，卵：一盯，出，州削饥，雌肌叫枷，：，瓢：血州衄野，舄：一【】碡协叶捌唧呻哪，咖讨町，：一舛有机溶剂对细胞的毒害及细胞的耐受性机制作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：王庆利， 何丹， 郑晓冬， 梅乐和浙江大学食品科学系,杭州,310029微生物学通报MICROBIOLOGY2002，29(4)10次 参考文献(15条)1.Zaks A.Klibanov A M 查看详情 19842.Inoue A.Horikoshi K 查看详情 19893.Aravalli N R 查看详情 19964.Femandes P.Pinheiro H M.Cabral J M S 查看详情 19985.Juan L R.Estrella D.Jose J 查看详情 19976.Sonja I.Antoine D.Wolffs Petra F G 查看详情 19997.Rani k S.Seenayya /doc/32b960d333d4b14e85246836.htmlG 查看详情 1999(02)8.Smet M J.Kingma J.Witholt B 查看详情 19789.Heipieper H J.Weberm F J 查看详情 199410.SikkemaJ.deBonrJM.Poolman B 查看详情 199411.Inoue A.Yamamoto M.Horikoshi K 查看详情 199112.Heipieper H J.Diefenbach R.Keweloh H 查看详情 199213.Chen Q.Janssen D B.Witholt B 查看详情 199514.Weber F J.BontJ A M 查看详情 199615.Gilberto M.JuanLR 查看详情 2000 相似文献(10条)1.学位论文 吴培 有机溶剂高耐受性酵母菌株的选育及细胞适应性机制研究 2008有机溶剂对微生物细胞的生理和代谢有一定的毒害作用,成为制约非常规介质中进行细胞生化反应的瓶颈。维持细胞高活性,筛选对有机溶剂的抗性或耐受性高的细胞,是提高生物催化的重要因素。因而探讨有机溶剂对细胞的毒性作用及细胞的自我调节适应性机制已成为研究的重点。本文首先比较了10种常见的有机溶剂对酿酒酵母细胞的毒性作用,发现不同有机溶剂对细胞的毒性大小不同,而有机溶剂的化学性质和极性共同决定着有机溶剂对酵母细胞的毒性。然后选择乙醇和丙酮这两种有机溶剂作为选择压力,筛选出了具有较强耐受性的酵母菌株Y-c-8和B-g-5,并对其生理生化特性进行了研究。通过胞外核苷酸浓度的测定,发现有机溶剂耐受性菌株的细胞膜通透性较出发株明显增大。透射电子显微镜观察到Y-c-8和B-g-5细胞结构发生了较大改变。虽然细胞膜界限仍很清晰,结构较完整,但整个细胞变小,细胞形态有皱缩,且细胞外层结构呈现单层,颜色变深,周围分散着大量颗粒。采用皂化法测定麦角固/doc/32b960d333d4b14e85246836.html醇含量,发现麦角固醇的含量与细胞对有机溶剂的耐受性成正比例关系,即对乙醇和丙酮的耐受性越强,其细胞麦角固醇的含量越高,最终两株有机溶剂高耐受性菌株Y-e-8和B-g-5的麦角固醇含量分别达到0.563和0.591,较出发株提高了30.32和36.81。对出发株、Y-c-8和B-g-5的细胞内脂肪酸组成进行分析测定。三株菌的细胞脂肪酸组成有很大差异。两株耐受性菌株中长链脂肪酸含量明显增加,短链脂肪酸甚至停止合成,最终长链多烯脂肪酸的含量占据总脂肪酸的一半左右,脂肪酸的不饱和度大大增加。本论文通过筛选有机溶剂高耐受性菌株并对其生理生化特性进行了研究,测定细胞膜通透性的变化,进而对细胞适应性机制麦角固醇含量和细胞脂肪酸组成进行了研究,为非水相介质中微生物细胞的利用奠定了基础。2.期刊论文 邹树平.张琦.李丽敏.郭燕霞.戴大章.李春.ZOU Shuping.ZHANG Qi.LI Limin.GUO Yanxia.DAIDazhang.LI Chun 水/有机溶剂体系中产紫青霉全细胞催化合成单葡糖醛酸基甘草次酸 -化工学报2009,60(8) 研究了产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3全细胞-D-葡萄糖醛酸苷酶在水/有机溶剂体系中催化水解甘草酸,合成单葡糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应.确定了最适反应体系为水/叔丁醇(体积比为3:7),最适反应条件为:底物甘草酸用量1.5 gL-1、反应温度45、pH值5.0、全细胞酶量7gL-1、摇床转速120 rmin-1,在此条件下反应48 h,产物GAMG产率可达79.12%,全细胞酶具有较好的稳定性和可重复使用性,显示了良好的应用前景.3.期刊论文 郭少三.朱海林.韩大良.周希瑜.黄畅.汪保和 四种有机溶剂对小鼠骨髓来源细胞体外生长和活力影响的量效关系分析 -岳阳职业技术学院学报2008,23(4)目的:观察乙醇、1,2-丙二醇、二甲基亚砜、吐温80对小鼠骨髓基质细胞(BMSC)、粒-巨噬系祖细胞(CFU-GM)和内皮细胞系细胞(BMEC)体外生长和活力的影响/doc/32b960d333d4b14e85246836.html,并分析量效关系.方法:分别设置不同终体积分数有机溶剂的细胞培养体系及其对照,检测成纤维形成单位(CFU-F)和CFU-GM的集落生成率.用MTT比色法和台盼蓝排斥试验测定BMSC和BMEC的细胞活力和活细胞率.结果:乙醇为1.6%、丙二醇为1.6%、二甲基亚砜为2%、吐温80为0.005%01%时,CFU-F和CFU-GM集落产率与对照组相比显著降低(P.BMSC和CFU-GM的细胞活力和活细胞率与对照组相比显著减低(P4.学位论文 刘雯雯 Pseudomonas putida Idaho有机溶剂耐受机理的研究 2009非水相生物转化和涉及到有机溶剂的环境微生物技术中，有机溶剂对微生物细胞具有毒性，能够破坏细胞膜，危害细胞结构和功能的完整性，抑制细胞生长甚至导致细胞的死亡。然而，有机溶剂耐受菌对有机溶剂具有一定的适应性，如降解有毒化合物、溶剂主动泵出系统、快速修复细胞膜、降低细胞膜通透性、改变脂肪酸的组成、降低细胞表面疏水性、膜泡的形成等。因此，有机溶剂耐受菌能够避开环境中有害有机溶剂的破坏作用，具有重要的应用前景。恶臭假单胞菌Idaho（Pseudomonas putida Idaho）是一株有机溶剂耐受菌，具有不同于其他有机溶剂耐受菌的溶剂耐受特性。该菌中含有降解多种芳香族化合物的基因，并且能够被有机溶剂诱导表达，但是其降解基因存在于染色体上，而不是质粒上。它不含有机溶剂外排泵系统，却能够耐受多种高浓度的有机溶剂，最高耐受浓度可达50（v/v）以上，还能以对二甲苯、甲苯以及其他烷基苯作为唯一碳源和能源生长。P putida Idaho在生物催化和生物修复领域具有重要的应用价值。对Pputida Idaho有机溶剂耐受机理的研究，可以增加对该菌的认识，为微生物基因改造提供新方法，对已知的微生物溶剂耐受机理是一个很好的补充，具有重要的基础理论意义。在应用方面，对该菌有机溶剂耐受机理的研究，有利于从中筛选重要的工业用酶，并为其全细胞在生物催化和生物修复领域中的应用提供重要的依据。在文献资料和实验室前期研究工作的基础上，本课/doc/32b960d333d4b14e85246836.html题采用荧光定量PCR技术以及双向电泳技术等实验方法，对Pputida Idaho的有机溶剂耐受机理进行了如下研究：1为了了解P putida Idaho有机溶剂耐受性与细胞膜合成的关系，选择磷脂合成途径中参与第一步反应的甘油磷酸酰基转移酶（PlsB）进行研究。甘油磷酸酰基转移酶（PlsB）能够利用完整的脂肪酸链形成最初的膜磷脂，在细胞膜的生物合成中起重要的作用。克隆得到Escherichia coliTop10和Pputida Idaho的plsB基因，在Ecoli中进行表达，并且验证了重组子的有机溶剂耐受性的变化。结果显示正确插入并正常表达外源plsB基因的转化子，在有机溶剂存在的情况下，对有机溶剂的耐受能力没有提高。说明甘油磷酸酰基转移酶对菌体的有机溶剂耐受能力没有促进作用。2研究Pputida Idaho中磷脂合成途径中的几个关键酶在有机溶剂压力下的表达变化。利用实时荧光定量PCR技术（qPCR）以及One-step RT-qPCR的方法，从转录水平对其进行定量分析研究。发现在不同浓度有机溶剂存在的情况下，各基因在转录水平上基本保持不变，从而进一步确定Pputida Idaho在有机溶剂存在时，细胞膜的合成速度并没有提高，该菌对有机溶剂的耐受能力并不是由细胞膜的合成速度变快决定的。3采用双向电泳的方法分析了Pputida Idaho在有机溶剂压力下的蛋白表达变化。对P putida Idaho样品制备方法进行了优化，确定了用于双向电泳的P。putida Idaho样品的制备方法，并实现了样品制备的可重复性，以及双向电泳实验的可重复性。实验证实该样品制备方法还可用于恶臭假单胞菌中其它菌株的双向电泳样品制备。通过对双向电泳蛋白质图的软件分析，发现了该菌株在有机溶剂存在和不存在的条件下蛋白表达的差异。4利用PDQuest软件对双向电泳图进行分析比较，获得了表达发生变化的蛋白的相关数据，利用MOLDI-TOF质谱仪对差异表达的蛋白进行鉴定，确定了这些蛋白的相关信息，并按照功能进行了分类。通过对有机溶剂压力下这些蛋白所发生的变化/doc/32b960d333d4b14e85246836.html进行的分析解释，进一步了解了P putida Idaho的有机溶剂耐受特性。5.期刊论文 别松涛.王珊.蒋彦洁.路福平.杜连详.BIE Songtao.WANG Shan.JIANG Yanjie.LU Fuping.DULianxiang 简单节杆菌AS1.94*细胞对有机溶剂的耐受性 -中国酿造2009(7)以糖代谢活力保留值T(%)为指标,研究简单节杆菌细胞在15种logPoct不同的有机溶剂中的耐受性.发现游离简单节杆菌细胞和固定化简单节杆菌细胞糖代谢活力保留值与溶剂logPoct值大致都呈S型曲线关系.考察了微生物的生长时期、摇床转速、摇床温度、水相介质等对游离简单节杆菌细胞有机溶剂耐受性的影响,结果发现,不同生长时期、摇床转速、摇床温度对简单节杆菌的有机溶剂耐受性有很大的影响,而采用不同的水相介质简单节杆菌的糖代谢活力保留值R(%)没有明显的差别.6.学位论文 李荣贵 有机溶剂/水两液相体系中甾体微生物C脱氢研究 2003该文首次采用有机溶剂/水两液相体系,研究了简单节杆菌(Arthrobacter simplex)游离细胞和固定化细胞对17-羟基-16-甲基-孕甾-4,9(11)-二烯-3,20-二酮(HMPDD)的C脱氢.测定了HMPDD和17-羟基-16-甲基-孕甾-1,4,9(11)-三烯-3,20-二酮(HMPTD)在十二种有机溶剂中的溶解度.结果表明苯、甲苯、二甲苯、乙酸乙酯和乙酸丁酯对HMPDD和HMPTD的溶解度较大,其中,乙酸乙酯对HMPDD和HMPTD的溶解度最大,分别为39.7g/L和87.5 g/L,乙酸丁酯其次,分别为32.6 g/L和53.4 g/L.随后,考察了这五种溶剂对简单节杆菌存活率的影响,在这五种溶剂中,二甲苯对简单节杆菌细胞的影响最小.最后,比较了这五种溶剂与水组成的两液相体系(两相体积比为1:1)中,游离简单节杆菌细胞对HMPDD的C脱氢,发现在以乙酸丁酯为有机相的两液相体系中,HMPDD的转化率最高,为51.8.在乙酸丁酯/水两液相体系中,研究了影响简单节杆菌游离细胞对HMPDD/doc/32b960d333d4b14e85246836.html转化的因素,结果表明底物浓度、维生素K加量、转化时间、摇床转速等因素对HMPDD的转化率有很大影响.此外,为了满足分析的需要,根据HMPDD和HMPTD的光学性质,构建了一种简便的HMPTD含量测定方法.7.学位论文 何军邀 微生物细胞非水相催化羰基化合物的不对称还原 2006在许多领域中，尤其是在药物工业领域，获得单一对映体纯的手性化合物是非常必要的。具有光学活性的卤代-羟基酯和1-苯乙醇衍生物是合成多种手性药物和其他生物活性化合物的重要砌块。结合非水相生物催化的优势利用微生物细胞催化不对称还原羰基化合物可以有效地制备这些手性醇。 建立了用气相色谱法测定手性醇对映体纯度的方法。用-环糊精(-CD)手性固定相在气相色谱上分离了乙酰化的4-氯-3-羟基丁酸乙酯，考察了色谱条件对分离的影响。然后拆分了各种外消旋醇，测定并计算热力学数据。结果表明，载气流速、柱温、程序升温速率、起始温度维持时间和进样量对对映体在-CD上的分离有明显影响；芳基醇无需衍生化普遍能得到较好的分离，-CD固定相对芳基醇的手性识别明显要优于直链羟基酸酯。通过热力学数据的分析认为，色谱分离过程中存在焓-熵补偿，这些化合物在-CD固定相上的拆分机理是基本一致的。考察了有机溶剂对微生物细胞的毒性。不同有机溶剂对出芽短梗霉GCMCC1244细胞的毒性各异，毒性大小与疏水性参数logP存在相关性，logP从3到5是有机溶剂对出芽短梗霉细胞有毒到无毒的过渡区；海藻酸钙细胞固定化可以减少有机溶剂对其的毒害作用；不同生长阶段的微生物细胞对有机溶剂的毒性反应不同，快速生长期(12h)的细胞较敏感。同一有机溶剂对枯草芽孢杆菌的毒性比出芽短梗霉和酵母要小，后两种微生物的毒性反应相近。在水/有机溶剂两相体系中用出芽短梗霉GCMCC1244细胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(CHBE)。CHBE在水溶液中比较稳定，而COBE容易被分解；两者对微生物细胞都有毒害作用，其中COBE的毒性要大于CHBE；邻苯二甲酸二丁酯是组成水/有机溶剂两相体系的最适有机相，在两相体系中可获得/doc/32b960d333d4b14e85246836.html较高的摩尔转化率、光学纯度和产物在有机相中的浓度。通过考察各种影响因素如相体积比、振摇速度、生物量/底物量比、温度以及pH发现，这些因素对反应的摩尔转化率和反应初速度有明显影响，但对产物的光学纯度的影响很小。经过条件优化后，有机相产物浓度可以达到58.2g/L，总摩尔转化率可以达到93.2，光学纯度大于97e.e.；固定化细胞反复利用不理想，COBE还原酶活力的损失并不是最主要的原因，而主要是因为固定化细胞经过反应后脱氢酶活力和还原酶的辅酶浓度大幅下降的缘故，影响了辅酶再生。筛选得到一株能高立体选择地催化还原TFAAE的菌株SaccharoinycesuvarumSW58，在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中可以得到较好的结果，优化条件下，摩尔转化率和产物的光学纯度分别可达85.1和85.4e.e.；添加合适的共底物、丙稀基溴处理细胞和用冻干细胞可以改善反应的立体选择性，细胞热处理对反应不利。用4种微生物分别在水相体系和水/有机溶剂两相体系催化还原了10种苯烷酮化合物。假丝酵母SW0401表现出很强的还原活力，10个底物被还原均有相应的产物醇生成，但立体选择性不高，酿酒酵母SW57对苯烷酮表现出普遍较高的立体选择性，这两种酵母催化苯乙酮还原反应遵循了Prelog规则。而在两相体系中出芽短梗霉SW0202催化苯乙酮衍生物的不对称还原反应遵循反Prelog规则。朱红密孔菌CGMCC1115的还原能力很低，仅能还原5种苯烷酮。苯烷酮苯环上取代基的电负性和结构能影响还原反应难易程度，取代基电负性强的容易被还原，取代基疏水性大不利于被还原；在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中考察了酿酒酵母SW57催化还原2-氯苯乙酮，乙醇是较理想的辅助底物，其水相浓度以30g/L为宜。还原反应的最适pH、温度和机相初始底物浓度分别为7.0、30和120mmol/；在上述最优条件下还原反应32h得到68.6的摩尔转化率和92.2e.e.产物的光学纯度。8.期刊论文 武明花.苏琦 4种有机溶剂溶解甲瓒颗粒的效果比较 -白血病淋巴瘤2003,12(3)到重视,并在肿瘤体外药敏实验中被广泛应用./doc/32b960d333d4b14e85246836.html9.学位论文 彭亮 醋酸杆菌细胞催化4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮不对称还原反应的研究 2009本论文从中华开菲尔菌粒中筛选到一株能高效、高选择性、遵循反Prelog规则催化TMSE不对称还原生成对映体纯(R)-TMSOL的醋酸杆菌，并且对比研究不同介质中醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原成(R)-TMSOL的反应过程，探讨离子液对该反应的影响规律，揭示含离子液介质中醋酸杆菌细胞的催化特性，并以此为基础，建立起可用于高效、高选择性合成对映体纯(R)-TMSOL的生物催化反应体系。从中华开菲尔菌粒中分离得到三株菌：XZY001、XZY003、XZY004。通过形态学和生理生化的初步鉴定，菌株XZYOOI属于乳酸菌中的乳杆菌属短乳杆菌种；菌株XZY004属于酵母菌中的毕赤酵母属；菌株XZY003属于醋酸菌中的醋酸杆菌属。其中，菌株XZY003催化TMSE不对称还原为(R)-TMSOL的效果最好，进一步的16S rRNA基因序列分析表明，其属于醋酸杆菌属亚种，命名为Acetobacter sp. CCTCC M209061。在供试的微生物菌种中，醋酸杆菌细胞能高效催化TMSE不对称还原生成(R)-TMSOL。在水相反应体系中，醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应的最适pH值、辅底物、辅底物浓度、反应温度、底物浓度和振荡速度分别是5.0、异丙醇、130.6mmol/L、30、6.0 mmol/L和180 r/min；在此最适条件下，反应的初速度、最大产率及产物的e.e.值分别为0.50mol/min、71和99以上。显然，最大产率和最适底物浓度较低，这可归因于水相中存在较为严重的底物和产物抑制、底物分解和逆反应。为了进一步提高反应底物浓度和反应效率，本研究尝试采用相转移的方法，以期利用第二相对底物和产物的萃取作用，降低水相中底物和产物的浓度，从而减轻底物和产物抑制、底物分解和逆反应。有机溶剂/缓冲液是常见的双相反应体系，为此，首先在不同有机溶剂与缓冲液组成的双相体系中进行醋酸杆菌细胞催化TMSE不对称还原反应。发现不同有机溶剂对该反应/doc/32b960d333d4b14e85246836.html的影响各异。在所研究的有机溶剂中，疏水性较强的正己烷为最适有机相。在正己烷/缓冲液双相反应体系中，该反应的最适两相体积比、底物浓度、缓冲液pH值、反应温度和振荡速度分别为1/2(缓冲液/正已烷)、9.0 mmol/L、5.0、30和180 r/min；在上述最佳反应条件下，反应初速度、最大产率和产物e，e.值分别为1.82mol/h、90和99。与水相反应体系相比，正己烷/缓冲液双相反应体系有效地解决了底物的分解等问题，显著提高了该反应的最适底物浓度和最大产率。然有机溶剂对细胞有一定的毒性作用，导致该反应速度较慢。为解决上述问题，本文采用具有良好生物相容性的疏水性离子液替代有机溶剂。在所研究的疏水性离子液中，C4MI