刺梨果实主要抗氧化组分对机械伤及 UV-B 胁迫的响应

园 艺 学 报 2012， 39 （4） ： 629636 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：收稿日期：20120104；修回日期：修回日期：20120314 基金项目：基金项目：贵州省优秀青年科技人才培养计划项目（黔科合人字 200704） ；国家自然科学基金项目（31060257） ；贵州省优秀科技教育 人才省长专项资金项目（黔省专合字 201012） ；贵州省农业科技攻关项目（黔科合农 G 字 20094003） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：anhuaming ） 刺梨果实主要抗氧化组分对机械伤及 UV-B 胁 迫的响应 杨 曼 1，安华明1,*，黄 伟1,2，张 雪1 （1贵州大学农学院，贵州省果树工程技术研究中心，贵阳 550025；2贵州省农业科学院园艺研究所，贵阳 550006） 摘 要：摘 要：以贵农 5 号刺梨为材料，研究了果实发育过程中主要抗氧化组分对机械伤及 UV-B 胁迫 的响应。结果表明：机械伤和 UV-B 处理均可诱导刺梨果实中 H2O2等自由基的产生，并促使膜脂过氧化 水平增加；但抗氧化系统对两种胁迫的响应模式不尽相同：机械伤胁迫下抗氧化酶 POD、SOD 以及非酶 组分 AsA、GSH 均受快速产生的 H2O2等自由基诱导，表现出快速应激响应；之后这两种抗氧化酶呈现出 逐渐降低的趋势， 而 AsA 和 GSH 则一直保持在较高水平。 在 UV-B 处理中， 需要较长时间额外增加 UV-B 辐射才会有效增加成熟果实中 SOD、 AsA 及 GSH 等组分的活性或积累； 而在减弱紫外处理时， SOD、 POD 和 GSH 的变化均表现出前期升高后期回落的趋势。机械伤和 UV-B 胁迫下，CAT 和 APX 等酶只是间或 或根本无法检测到活性。总体上看，POD + SOD 以及 AsA + GSH 的共同作用是刺梨果实在这两种胁迫下 抗氧化反应的主要机制。 关键词：关键词：刺梨；机械伤；UV-B；抗氧化系统 中图分类号：中图分类号：S 661 文献标识码： 文献标识码：A 文章编号： 文章编号：0513-353X（2012）04-0629-08 Response of Main Antioxidant Compositions to Mechanical Wounding and UV-B Stress in Rosa roxburghii Fruit YANG Man1，AN Hua-ming1,*，HUANG Wei1,2，and ZHANG Xue1 （1Agricultural College，Guizhou University，Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops，Guiyang 550025， China；2Horticultural Institute，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang 550006，China） Abstract：Rosa roxburghii TrattGuinong 5was used to investigate the response of antioxidant system to mechanical wounding and UV-B stress during fruit development. The results showed that the reactive oxygen species and membrane lipid peroxidation were all induced by the both stress treatments， but different defense response patterns of antioxidant system were observed. In wounded fruits，the antioxidant enzymes such as POD，SOD and some antioxidant substances of AsA or GSH were provoked immediately leaded by H2O2 production. Then，with the redox prolonged，the enzyme activities decreased gradually while the contents of AsA and GSH still maintained a high level. Longer-term supplement of UV-B radiation would contribute to SOD activity or AsA and GSH accumulation，and then to the nutritional values in the fruit. In the condition of weakened UV-B treatment （UV） ， activities of SOD and 630 园 艺 学 报 39 卷 POD and content of GSH increased in early development stage but decreased in ripening fruit. POD，but not CAT or APX plays a role of sensitive factor to these kinds of stress. These data reveal that cooperation of antioxidases of POD and SOD with antioxidants of AsA and GSH should be the main ROS-scavenging mechanisms to sense the environment stress and react appropriately by keeping the cellular redox balance in the fruits. Key words：Rosa roxburghii；mechanical wounding；UV-B radiation；antioxidant system 人类生产活动或昆虫造成的机械损伤和因大气臭氧层减薄而导致的中波紫外线（UV-B）增强是 植物常常要遭遇到的逆境胁迫。植物在受到逆境胁迫时常常会产生大量的活性氧自由基，但同时植 物体内又存着活性氧自由基清除机制，包括抗氧化酶系统如超氧化物歧化酶（SOD） 、过氧化物酶 （POD） 、 过氧化氢酶 （CAT） 、 抗坏血酸过氧化物酶 （APX） 等和抗坏血酸 （AsA） 、 谷胱甘肽 （GSH） 等一些非酶组分（Fang et al.，2002；Mittler，2002） 。植物体内的抗氧化反应是一个非常复杂的过程， 不同种类、不同器官以及不同氧化胁迫形式下发挥的作用和响应机理不尽相同（Grantz et al.，1995； 吴杏春 等，2001；Mittler，2002；Ernesto et al.，2004；He et al.，2004；李会云和郭修武，2008； 付晓记 等，2011；罗娅和汤浩茹，2011；郑小林 等，2011） 。 刺梨（Rosa roxburghii Tratt）果实积累有极丰富的抗坏血酸（L-ascorbic acid，AsA） ，之前对其 在成熟衰老过程中与其它抗氧化组分的协作机制进行探索时发现只有部分组分发挥 （主要） 作用 （安 华明 等，2005a，2005b，2007；黄伟 等，2009） 。本试验中拟增加胁迫程度，通过测定刺梨果实发 育过程中在机械伤和 UV-B 处理下抗氧化系统各主要组分的变化，以期更加深入地探讨其对逆境胁 迫可能的响应机理。 1 材料与方法 1.1 材料 试验材料为 6 年生刺梨（Rosa roxburghii Tratt）优良无性系贵农 5 号 （樊卫国 等，2011） ， 种植于贵州大学刺梨种质资源圃。用于试验的植株为 80 株，所有处理重复两年（2008、2009 年） 。 1.2 处理 机械伤处理：于果实成熟前的 8 月初进行。选取树冠外围大小基本一致的果实，用洁净的小刀 （厚度约 0.5 mm）纵向均匀地切 4 条长约 1.5 cm，深约 2 3 mm（以不露种子为宜）的伤口。分别 于处理 0、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h，共 11 个时间点取样，每次取果数量不少于 10 个。 UV-B 处理：于 5 月至 8 月，在自然光照下，采用 40 W 中波紫外线灯管（UV-B，308 nm，购 于北京中瑞达电光源厂）对 10 株刺梨进行加强紫外辐射处理（+ UV） ，灯管水平架设在距植株上部 约 0.5 m 处，每天 11：0015：00 照射 4 h，树冠上部增加的辐射剂量约为 5.3 kJ m-2 d-1；另采用 厚度为 0.105 mm 的聚酯薄膜对 10 株刺梨进行过滤紫外光处理（紫外减弱，UV） ，聚酯薄膜架在 树体上部 0.5 m 处，略向南倾斜；以不进行处理的植株作为对照。于开始处理（5 月 18 日）后 30、 50、70、90 d 分别采集树冠外围中上部大小基本一致的果实，每次取果不少于 200 g（数量 20 50 个不等） 。 每次采集的样品经液氮处理后放入70 的超低温冰箱保存，供试验分析用。 4 期 杨 曼等：刺梨果实主要抗氧化组分对机械伤及 UV-B 胁迫的响应 631 1.3 生理指标测定 参照林植芳等（1988）的方法测定 H2O2含量；参照邹琦（2000）的方法测定丙二醛（MDA） 和可溶性蛋白含量；GSH 含量采用 DTNB 还原法测定（Griffith，1980） ；参照安华明等（2005a）提 供方法测定 AsA 含量；APX、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）和单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR） 活性测定采用分光光度计法 （Stasolla & Yeung， 2001） ； SOD 活性测定采用氮蓝四唑法 （邹琦， 2000） ； POD 活性测定采用愈创木酚法 （陈建勋和王晓峰， 2002） ； CAT 活性测定采用紫外分光光度计法 （陈 建勋和王晓峰，2002） 。 本研究中所得数据取两年试验的平均值，且每一指标的测定均重复 3 次以上，用 DPS 软件对数 据进行统计分析。 2 结果与分析 2.1 机械伤及 UV-B 胁迫下刺梨果实中 H2O2、MDA 和可溶性蛋白含量变化 图 1 显示：刺梨果实在受到机械损伤后 1 h 以内就导致 H2O2的产生，说明机械损伤会迅速造成 图图 1 机械伤（左）和机械伤（左）和 UV-B（右）胁迫下刺梨果实（右）胁迫下刺梨果实 H2O2、MDA 和可溶性蛋白含量变化和可溶性蛋白含量变化 Fig. 1 Changes of H2O2，MDA and soluble proteins content dealing with mechanical wounding（left）and UV-B（right）stress in R. roxburghii fruit 632 园 艺 学 报 39 卷 氧化胁迫，并在随后较长时间内导致膜脂过氧化（MDA 含量升高） ；之后，随着抗氧化组分的参与， H2O2含量迅速降低。但在处理的 24 36 h 期间，H2O2、MDA 和可溶性蛋白含量再次升高，其原因 可能与伤口开始愈合及活性氧在信号转导中的多重作用有关，但具体过程尚需深入研究。 与对照相比，增加和减弱 UV 照射 30 d 内均会使 H2O2增加，但随着果实发育似乎减弱 UV 更 容易导致 H2O2产生。长时间 UV 照射对刺梨果实膜的损伤是持续性的（MDA 含量一直保持在较高 水平） 。增加和减弱 UV 照射在后期对提高可溶性蛋白含量也很明显（图 1） 。 2.2 机械伤及 UV-B 胁迫下刺梨果实主要抗氧化酶活性的变化 表 1 显示，POD 和 SOD 都会在刺梨果实受伤后迅速作出反应，只是 POD 的活性增加的幅度更 大；之后两者均开始降低，但 POD 降低的程度也更大，至 36 h 后其活性已降至对照的约 1/2。与 H2O2和 MDA 类似，SOD 在伤处理后期（24 h 后）也表现出一定的回升趋势。 表表 1 机械伤处理刺梨果实抗氧化酶活性变化机械伤处理刺梨果实抗氧化酶活性变化 Table 1 Changes of antioxidase activity to mechanical wounding stress of R. roxburghii fruit SOD/(U g-1 FW) CAT/(U g-1 FW) POD/(U g-1 FW) 处理时间/h Time after treatment 伤处理 Wounding treatment 对照 Control 伤处理 Wounding treatment 对照 Control 伤处理 Wounding treatment 对照 Control 0 50.13 5.34 abc 49.35 5.81 a ND ND 21.05 2.29 cd 21.02 5.24 a 1 56.21 5.50 a 52.21 4.87 a ND ND 30.88 2.34 a 19.72 3.25 a 2 56.27 3.20 a 50.66 5.19 a ND ND 26.39 2.19 ab 23.72 2.71 a 4 55.64 6.20 a 51.26 5.02 a 34.71 4.58 ND 26.80 4.66 ab 22.19 2.47 a 6 53.78 5.34 ab 50.57 4.70 a ND ND 23.53 2.44 bc 21.82 1.97 a 8 48.17 4.20 abc 49.21 6.10 a ND ND 24.09 1.49 bc 22.47 3.05 a 10 44.76 4.98 bc 48.53 5.80 a ND ND 20.89 4.74 cd 23.42 2.50 a 12 43.45 3.98 c 48.57 5.46 a 26.98 4.21 ND 21.18 2.13 cd 20.49 2.44 a 24 41.28 3.71 c 50.38 3.96 a 48.00 5.89 ND 17.74 2.37 d 22.72 3.27 a 36 47.38 4.74 abc 50.57 6.92 a ND ND 11.20 2.54 e 19.80 2.21 a 48 49.41 6.72 abc 51.26 2.98 a ND ND 10.79 1.41 e 22.61 2.14 a 注：ND. 未检测到；同列数值不同字母表示差异达 5%显著水平。下同。 Note：ND. Not detected；Different letters within the same column indicate significant differences at 5% level. The same below. 无论是增强或减弱 UV-B 照射，POD 活性的变化基本相似：处理前期（30 d 内）均表现出显著 升高，之后迅速降低；尤其是UV 处理下其活性的前期响应幅度甚至比+ UV 处理更大，但至果实 成熟时两种处理果实内的 POD 活性基本和对照相当（表 2） 。 就 SOD 而言，短期增强 UV-B 照射对其活性并无多大影响，较长时间的 + UV 处理才能有效增 强其活性；与此相反，减弱 UV 短期内即可使果实内 SOD 活性显著升高，之后又很快降低至对照的 水平。 表表 2 UV-B 处理刺梨果实抗氧化酶活性变化处理刺梨果实抗氧化酶活性变化 Table 2 Changes of antioxidase activity to UV-B stress of R. roxburghii fruit SOD/(U g-1 FW) CAT/(U g-1 FW) POD/(U g-1 FW) 处理时间/ d Treatment days + UV 对照 Control UV + UV 对照 Control UV + UV 对照 Control UV 30 46.08 3.46 b 47.13 3.80 a 68.65 6.45 a ND ND ND 60.50 10.81 a 45.95 6.26 a 83.28 5.40 a 50 48.13 4.51 b 42.46 3.17 a 50.25 4.65 b 12.99 3.67ND ND 43.50 5.19 b 39.50 3.17 a 26.01 3.63 b 70 45.18 4.98 b 45.99 4.17 a 44.41 3.57 bc 23.57 5.49ND ND 26.19 4.32 c24.39 2.19 b 18.22 7.42 b 90 74.17 6.41 a 42.58 3.14 a 37.90 3.16 c ND ND ND 23.37 4.29 c27.74 1.22 b 26.22 3.71 b 4 期 杨 曼等：刺梨果实主要抗氧化组分对机械伤及 UV-B 胁迫的响应 633 2.3 机械伤和 UV-B 胁迫下刺梨果实 AsA 和 GSH 含量变化 图 2 表明，AsA 在果实受到机械损伤后迅速响应，2 h 内就增加了约 23%，并在 10 h 内保持持 续上升的趋势，在整个处理期间其含量均显著高于非处理果实；而 GSH 的响应在前期虽然稍缓，但 总体上也一直保持增加的态势。图 2 同时显示，果实发育过程中增加 UV-B 处理对 AsA 和 GSH 的 影响是一个长期效应，长时间适当增强紫外照射对于促进成熟刺梨果实中这类抗氧化物质的积累是 有利的。这一结果可以作为部分解释前人关于“刺梨果实中 AsA 含量有随着所处地海拔升高而增加 的趋势”规律的原因（罗登义，1987） 。减弱紫外照射处理下，GSH 与 SOD 和 POD 类似，均表现 出处理前期急剧增加，然后快速降低的变化趋势。 图图 2 机械伤（左）和机械伤（左）和 UV-B（右）处理下刺梨果实（右）处理下刺梨果实 AsA 和和 GSH 含量的变化含量的变化 Fig. 2 Changes of AsA and GSH content dealing with mechanical wounding（left）and UV-B stress（right）in R. roxburghii fruit 3 讨论 植物细胞内有很多活性氧的潜在来源，即使是正常的光合和呼吸作用也会导致活性氧自由基 的产生（Mittler，2002） 。逆境胁迫会打破活性氧自由基产生清除平衡，导致其代谢失调和异常 积累，从而对植物造成伤害。然而，活性氧自由基也不只是起不利作用（王爱国，1999） ，尤其愈 来愈多的研究表明它在参与植物细胞的信号转导等过程中发挥着重要作用（Kovtun et al.，2000； Samuel et al.，2000） ，抗氧化组分也会受其诱导（Mittler，2002；阮英 等，2006） 。本研究中，无 论是机械伤还是 UV-B 胁迫，均会在前期导致 H2O2的显著增加，并不同程度地伴随着各抗氧化组 分的相应变化。 由于 SOD 能歧化超氧阴离子自由基产生 H2O2， 进而由 POD 等分解 （王爱国， 1999） ， 因此虽然两种氧化胁迫下两种抗氧化酶的响应模式不尽相同，但可以看出这两种酶在参与刺梨果 实的氧化应激和抗氧化反应过程中起着非常重要的作用。在机械伤胁迫处理过程的后期（24 36 634 园 艺 学 报 39 卷 h） ，H2O2含量出现一个意想不到的增加态势，同时伤口开始愈合，鉴于活性氧（尤其是 H2O2）在 细胞壁形成、木质素合成与降解等过程中的重要作用（王爱国，1999） ，因此推测这一时期的变化 可能与此有关。 此外， 以往有研究表明， 山竹等果实碰伤后会导致木质素的增加 （Ketsa & Atantee， 1998） ，而 POD 参与了木质素的生物合成，因此该酶在果实防御过程中的作用是多方面的。 抗氧化系统的各组分在植物体内有各自的功能分工，正是他们之间的这种协同作用为植物在发 生氧化胁迫时提供了必要的自我保护。SOD、POD、CAT 等是植物体内清除活性氧自由基的重要抗 氧化酶类，它们之间的协同作用可有效阻止活性氧的过量产生对细胞所造成的氧化伤害（Mittler， 2002；马旭俊和朱大海，2003；付晓记 等，2011；罗娅和汤浩茹，2011；郑小林 等，2011） 。AsA 和 GSH 都是植物非保护酶抗氧化系统的重要组分， 它们可以直接清除植物体内因氧代谢、 光合作用 及环境胁迫等产生的 ROS，从而对植物细胞起保护作用（Liebler et al.，1986；Padh，1990；Asada， 1992；Mittler，2002；郑小林 等，2011） 。但是不同植物种类、不同氧化胁迫形式下抗氧化系统具 有不同的响应机制。在刺梨果、叶成熟和衰老过程中的相关研究也发现两种器官内不尽相同的抗氧 化响应过程和自由基清除机制（安华明 等，2005b，2007） 。本研究结果显示，在两种不同的氧化 胁迫下刺梨果实中抗氧化组分的响应模式也有差异。由于机械伤害较为直接，H2O2等自由基的产生 较快，因此 SOD、POD 等抗氧化酶以及 AsA、GSH 等抗氧化组分均表现出较为快速的应激反应， 它们在较短时间内迅速增加无疑对于清除迅速积累的活性氧自由基是有益的；同时，活体条件下抗 氧化组分的这一变化模式与伤害程度更大的离体胁迫条件下也有很大的区别（黄伟 等，2009） ，再 次表明植物抗氧化机制的复杂性。增强 UV-B 处理（+ UV）下各抗氧化组分的变化与机械伤胁迫有 较大的差异，SOD、AsA 以及 GSH 等只在处理后期才显著增加，表现出一种长期效应；倒是减弱 UV-B 处理（UV）在前期更易导致 H2O2积累、诱导 SOD、POD 活性和 GSH 含量的增加。 在所有抗氧化组分中，POD 在胁迫处理的前期表现出较为一致的敏感性，而另一种抗氧化作 用大致相似的酶类 CAT 只间或检测到活性，这似乎表明该酶可能并不是刺梨抗氧化酶系统的主要 组分。另外，参与 AsA 代谢、循环和抗氧化的 APX、MDHAR 及 DHAR 等酶的活性无论是在成 熟衰老（安华明 等，2005b，2007） 、离体损伤（黄伟 等，2009）或在本试验中的两种胁迫过程 中均无法检测到。由此可以看出，POD + SOD 以及 AsA + GSH 的共同协作是刺梨果实在这两种胁 迫下抗氧化反应的主要机制。 References An Hua-ming，Chen Li-geng，Fan Wei-guo，Liu Qing-lin. 2005a. 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