生物固氮原理、应用和它的研究进展.doc

生物固氮的原理、应用及研究进展摘要：生物固氮是自然生态系统中氮的主要来源全球生物固氮的量是巨大的，海洋生态系统每年生物固氮量在四百万吨到两千万吨，陆地生态系统生物固氮量在九百万吨到一千三百万吨，而工业固氮量在世纪年代中期每年约为一千三百万吨。可见，生物固氮在农林业生产和氮素生态系统平衡中的作用很大我国农民利用豆科植物固氮肥田历史悠长，直至现在仍保留着豆科植物和非豆科植物轮作套作和间作等耕作制度国外也十分重视固氮生物在农业中的作用。关键词：生物固氮；联合固氮菌；自生固氮菌一、生物固氮的原理1982年，Postage 以肺炎克氏菌为例提出一个固氮酶催化机理模式，至今仍被广泛采用其总反应式为：N2 + 6H+ + nMg-ATP +6e-(酶)2NH3+nMg-ADP+nPi固氮微生物的固氮过程是在细胞内固氮酶的催化作用下进行的不同固氮微生物的固氮酶，其催化作用的情况基本相同在固氮酶将还原成的过程中，需要e和H+，还需要ATP提供能量生物固氮的过程十分复杂1，简单地说，即在ATP提供能量的情况下，e和H+通过固氮酶传递给N2，使它们还原成NH3，而乙炔和N2具有类似的接受e还原成乙烯的能力。二、固氮微生物的种类固氮微生物多种多样，不同的划分标准满足了不同的要求。从它们的生物固氮形式来分，有自生固氮、联合固氮、和共生固氮3种。自生固氮微生物是指能够在自由生活状态下固氮的微生物总称。在自然界，自生固氮微生物种类很多，分散地分布在细菌和蓝细菌的不同科、属和不同的生理群中；并大致可以分为光合细菌和非光合细菌两类。前者如红螺菌、红硫细菌和绿硫细菌等，其中的某些种类可与其它微生物联合而相互有利；后者的种类很多。根据非光合细菌的自生固氮菌对氧的需求，可以分为厌氧的细菌如梭状芽胞杆菌2；需氧细菌如自生固氮菌、贝捷林克氏固氮菌、固氮螺菌等；以及兼性细菌如多粘芽胞杆菌、克鲁伯氏杆菌、肠杆菌等。自生固氮微生物中的某些种类，在有些情况下可以与植物进行联合固氮。一般地，自生固氮微生物固定的氮素满足本身生长繁殖需要以后就不再固氮了，多余的氮反过来会抑制它们自身的固氮系统。同时，它们固氮效率也比较低。据测定，每消耗1克碳水化合物，自生固氮微生物固定10毫克氮，而共生固氮的根瘤菌则可以固定270毫克氮。所以，这个类群的微生物从固氮量的角度衡量，对作物的氮素供应的贡献并非很大。许多试验结果证明，这类微生物所产生的各种激素和其它活性物质是促进作物生长的主要因素之一。联合固氮微生物有些自生固氮微生物在特定植物根际环境中生长、繁殖比非根际土壤中旺盛得多，这是由于植物根系的分泌物和脱落物提供能源物质，固氮微生物利用这些能源物质生活和固氮，这种互利关系称之为联合固氮。联合固氮体系最先是在雀稗和雀稗固氮菌之间发现，后来发现小麦、水稻和C4作物如甘蔗、玉米、高粱等禾本科植物亦存在联合固氮体系。能够进行联合固氮的微生物种类较多，似乎没有什么特异性2,3，有些微生物既可以在自生条件下进行自生固氮作用，又能在田间与一些禾本科作物进行联合固氮作用。已经报道过的联合固氮的主要微生物种类有：浸麻芽胞杆菌、多粘芽胞杆菌、巴西固氮螺菌、含脂固氮螺菌、克鲁伯氏杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌和粪产碱杆菌等。与共生固氮相比，联合固氮微生物与植物之间的关系不紧密，双方也没有共同的组织结构，因而固氮效率也不可能高。目前，对于联合固氮体系的固氮量很难有一个比较准确的估计，一般认为每亩地每年约为0.51斤纯氮。共生固氮微生物是指能与宿主植物形成特定固氮组织结构的一类微生物。它们彼此生活在一起，植物向微生物提供光合产物供微生物固氮需要，微生物则向植物提供氮素营养，双方互相有利。以豆科植物-根瘤菌共生体系来说，由于有根瘤组织作为它们的共生结构，共生效率是最高的。其原因是这种共生体系满足了上述所说的生物固氮的条件。已知的比较清楚的共生体系除了豆科植物-根瘤菌共生体系外，还有非豆科植物-固氮放线菌体系和红萍-固氮蓝藻共生体系。与相应的豆科植物共生固氮的根瘤菌很多，迄今从豆科植物根瘤中分离出来并进行过研究的约有100多种，在生产上应用的种类不足1/5。在分类上确定了分类地位的现在有5个属，它们分别是：根瘤菌属、慢生根瘤菌属、中华根瘤菌属、固氮根瘤菌属和中慢生根瘤菌属。每个根瘤菌属包括至少1个种。和上述的自生固氮和联合固氮比较，共生固氮效率高，固氮量多，对于人类的意义和农牧业生产的作用也最大4。迄今研究最为清楚、应用最多的是豆科植物根瘤菌共生固氮体系，据测定，一般每年每亩固定纯氮约为13.3公斤，约折合每亩地每年固定标准化肥130斤，且几乎全部被利用。三、当前生物固氮的主要研究方法有哪些在固氮生物研究中，最经典的测定技术是凯氏定氮法其后，由于同位素示踪法的出现，采用了15N示踪法测定固氮量，比凯氏法的灵敏度提高1000倍。1966年以来，应用乙炔还原法测定固氮酶活性是生物固氮研究中的一大突破，这一革新把生物固氮研究推向了一个新的阶段其灵敏度比15N示踪法还要高1000倍，而且方法简单速度快，适于生物固氮方面研究，氮累计法该方法在生物固氮早期研究中成功运用过，但准确率较低。示踪法：在固氮研究中，目前15N稳定性同位素被认为是最有效而实用的工具。 15N示踪法的灵敏度比常规凯氏定氮法高1000倍，且不需校正因子但其缺点是：（1）15N的价格较昂贵，需用较为复杂的质谱仪测定；（2）测定的手续较繁琐，不易准确定量；（3）其灵敏度较乙炔还原法低1000倍。该方法是用塑料袋先将植物封住，抽出里面的空气，导入高丰度的15N，经过一段时间后取出样本，用凯氏定氮法消化蒸馏，用Hg2+或CUSO4作催化剂，把15N转化为15NH4，在高真空中用次溴酸盐将15NH4转化为15N2，直接导入质谱仪中进行分析5。同位素稀释法：同位素稀释质谱法是通过同位素丰度的精确质谱测量和所加入稀释剂的准确称量，求得待测样品中某元素的绝对量，有效地把元素的化学分析转变为同位素测量，因此具有同位素质谱测量的高精度和化学计量的高准确度但其缺点非常明显：（1）需要浓缩同位素，成本高；（2）样品制备复杂，花费时间长，易受污染乙炔还原法1966年，R Schoollhorn和R H Burris以及澳大利亚Murdoch大学的MJDilworth发现固氮酶可以使乙炔还原为另一种气体-乙烯年等用这种方法对自生固氮菌固氮酶提取液大豆根瘤等做了测定也对大豆根瘤进行了测定1968年，乙炔还原法测定活性已成为国际上固氮研究中最重要的测定技术乙炔还原法灵敏度高，比示踪法高1000倍，而且方法简单速度快除此之外，它还可进行生物固氮各方面的研究如自生固氮菌细胞或酶的提取液豆科或非豆科根瘤藻类禾本科植物根际联合固氮等等它可以离体测定，也可以整株活体连续测定或原位测定该方法是将待测材料置于容器中，注满乙炔，反应一定时间后，用气相色谱仪测定乙烯的生成量，以单位时间内一定量样品所产生的乙烯量来表示固氮酶活性此法速度快，灵敏度高这一方法的建立使生物氮研究方法取得了重要突破6,7,8。15N自然丰度法：自确定用大气中15N丰度作为的标准自然丰度以来，利用固氮植物和非固氮植物利用有效氮源的不同而形成的植物15N丰度的差异来测定生物固氮量，已逐渐成为一种应用范围较广的定量研究生物固氮手段，即自然丰度法这是目前国际上日益受到重视的一种方法，精度和同位素稀释法接近，但成本便宜。四、联合固氮菌目前的研究进展及未来研究方向联合固氮菌是固氮生物中重要的类群，在为植物特别是粮食作物提供氮素、降低化肥用量、减少环境污染、维持生态平衡和促进农业可持续发展等方面发挥着重要作用，并因此成为国内外学者研究的热点。由于联合固氮细菌与植物之间是一种松散的结合，未能形成稳定的共生结构，因而受根际土壤因素的影响较大，这也给联合固氮菌的研究带来一些困难。目前联合固氮作用研究主要有以下方面:联合固氮菌的鉴定及其在植物根部的定位观察。对联合固氮体系建立过程中的形成机理和根际微生态系统中植物、土壤和细菌三者间的作用机理的阐明。由于结合态氮是抑制固定大气氮的主要因素，如何获得能高效固氮的耐铵型菌株是亟待解决的问题之一9。联合固氮菌之间的相互关系及协同作用。将联合固氮菌引入禾本科植物根内，诱导植物形成固氮根瘤。固氮能源的供给及组成。虽然联合固氮的固氮效应不及共生固氮高，但其分布广，受益作物多，因此对于非豆科植物而言11,12，联合固氮可能成为将来农、林、牧业中潜在的稳定氮源，其生态意义和经济效益都是不可低估的。五、自生固氮菌目前的研究进展及未来研究方向有些高等植物与菌根真菌共生形成菌根，非豆科固氮植物固氮能力强，是陆地生态系统中重要的供氮系统，植物内生菌与寄主植物在长期的共同进化过程中形成共生关系13。它们通过固氮作用，产生生理活性物质促进宿主对环境的适应， 在农业中具有重要的应用潜力。近年来，在甘蔗、玉米中发现了多种具有固氮功能的内生细菌，引起了学术界的高度关注。这一发现不仅对生物固氮调控有重要意义，也是对基因表达调控的基础研究中的一项重要贡献。它为进一步研究光合和固氮之间的联系，提供了理论基础。如果固氮微生物体内具有氢酶，可以吸收氢产生的能量。这样，就能提高其固氮效率而增加产量。目前，利用基因工程技术转移固氮基因从而使植物表达固氮作用已成为一项世界性的战略课题。许多国家的科学家都在运用现代生物技术从事固氮菌的固氮机理和转移微生物固氮能力等各方面的研究，展现固氮菌生物固氮的前景。针对目前固氮菌研究中存在的问题，目前关于固氮菌的发展主要集中在以下几个方面14：1、改进现有固氮微生物的固氮效率改变固氮酶作用中的放氢耗能反应。由于固氮作用要消耗一定的能量，即消耗了植物光合作用的产物。因此可以设想，应用基因工程手段，组建菌株，使释放的能量再用于固氮酶的固氮作用8。培养菌株，解除抑制固氮酶合成，使固氮菌环境中能结瘤固氮。2、利用生物工程技术， 构建新的固氮微生物原核生物间的遗传性能转移是比较容易的。应用质粒转移培育高效固氮的根际细菌群，开辟根际细菌转人固氮质粒的研究15,16。3、建立新的共生固氮体系共生固氮体系是生物界中最有效的固氮组合。固氮作用所需要的能量来自宿主植物的光合作用。固氮产物直接为宿主的氮素营养，共生的两方面相互有利，相互支持。但是，对农、林和牧业生产有价值的共生固氮体系，在自然界中仅限于少数微生物与有限的豆科植物共生。研究扩大根瘤菌的共生范围，使能在其它植物上结瘤固氮。或将固氮基因导入高等植物细胞， 创建能固氮的高等植物，自给氮素营养的植物类型是非常有意义的。4、加强固氮菌遗传工程的研究从目前的研究现状来看，试图通过基因工程将固氮基因(nif)从豆科植物转移到非豆科农作物中难度比较大，在短期内很难实现，而采用细胞工程方法将根瘤菌导入非宿主农作物细胞内则切实可行17,18,19。5、建立新的共生固氮体系由于Frankia菌具有对宿主的侵染范围宽、固氮活性比较强和对氨气不敏感等特性，在生物固氮研究中对Frankia茵的研究将更为重要，有可能由此会找到新的突破口。在Frankia菌与农作物之间建立起新的共生固氮体系将具有更大的可能性20,21。 随着生物科学的快速发展和对环境保护的日益重视，固氮菌必将引起更多的关注与研究，固氮微生物在农业发展、环境保护、工业生产等方面的应用将更加深入的展开，人类也将从中获益匪浅22。六、生物固氮的展望近年来，生物固氮研究发展迅速，已成为一项世界性的战略课题。各国都对其做了大量的研究工作，取得了耀人的成绩。目前，生物固氮已经成为一个多学科的综合性研究项目，分别在分子、细胞、个体和生态等多层次水平上，从微观到宏观不断地展开着探索性研究2325。从目前的研究现状来看，试图通过基因工程将固氮基因从豆科植物转移到非豆科农作物中难度比较大26，在短期内很难实现，而采用细胞工程方法将根瘤菌导人非宿主农作物细胞内则切实可行。除此之外，由于Frankia菌具有对宿主的侵染范围宽、固氮活性比较强和对氨气不敏感等特性，在生物固氮研究中对Frankia茵的研究将更为重要，有可能由此会找到新的突破口。在Frankia菌与农作物之间建立起新的共生固氮体系将具有更大的可能性。另外，高效生物固氮作用机理研究要求生物学、农学、化学、和物理学在固氮酶的结构功能和化学模拟、氮基因表达中铵遏氧敏感、共生结瘤固氮中植物与微生物相互关系的基因表达和调控、结瘤因子的结构和人工合成、固氮根瘤及其宿主植物的基因组学、功能基因组学和蛋白质组学等在分子和原子水平上，从不同方面相互交叉、有机结合，引进新概念、新技术进行综合研究。在21世纪生命科学和生物技术的世纪，相信，生物固氮的研究将会给人类带来巨大的影响，使人们生活更加美好。参考文献1卢嘉锡,蔡启瑞,万惠霖,等.生物固氮：全球的挑战和未来的需要J. 辽宁科技参考, 2011 (4): 262陈今朝,向邓云.生物固氮的研究应用J.涪陵师专学报, 2010, 16 (2): 963Chen W, Wang E , Wang S, et al. 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