DNA分子标记技术在物种鉴定和系统分析中的应用.doc

DNA分子标记技术在物种鉴定和系统分析中的应用刘派(北京科技大学化学与生物工程学院生物技术系，北京市100083)摘要：随机扩增多态DNA(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)，是美国学者Williams和Welsh于1990年首先提出的该技术是通过分析DNA的PCR产物的多态性来推测生物体内基因排布与外在性状表现的规律的技术。RAPD技术是以8-lObp的随机寡核苷酸片段作为引物，对基因组进行PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或PAGE电泳检测后显色，分析扩增产物DNA片段的多态性，此即反应了基因组相应片段由于碱基发生缺失、插入、突变、重排等所引发的DNA多态性。至今，该技术已广泛应用于种质资源研究，作物遗传多样性分析，基因定位，找特定基因，如抗性基因、雄性不育恢复基因等可连锁的标记和物种识别，植物系统进化研究等多个领域，本文以草坪草为实验对象进行RAPD标记技术的应用。关键词：RAPD分子标记；凝胶电泳；草坪草；随机扩增；DNA引言RAPD技术一方面继承了PCR率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点。此外，与其它DNA多态性分析方法相比。RAPD技术还表现出很多独特的优势和特点:（1）不必知道被测DNA特异性位点序列信息；（2）模扳DNA的量极少；（3）RAPD技术操作简便快速；（4）RAPD所用引物均为人工定序合成；（5）基因型的检测自动化。本实验在液氮环境下提取六种植物的DNA后，用实验室编号为131-136的引物对六种DNA进行随机扩增，接下来对其进行TBE凝胶电泳实验操作，得到跑胶结果并对其进行分析。1 RAPD标记原理1.1 原理技术利用一系列随机引物，以为模板，通过基因放大器进行多态性片段的随机合成如果某一引物与某一片段的模板具有互补的核苷酸顺序该引物就会结合到单链的模板上，在具有种游离的情况下通过聚合酶连接链就会从引物的端开始，某一引物可能会与单链的许多地方结合但只有在个碱基对以内存在反向平行的某一引物互补的双链分子，才可能将合成的新链作为下一次合成的模板这个反应由个不同温度的反应步骤连续循环所组成第一步欲扩增双链的变性双链在加热变成单链，快速冷却阻碍了单链的重新结合第二步，退火，随机寡核苷酸引物互补地靠在模板链的目标位置上退火温度通常在对于理想的技术条件按经验必须优化第三步适温延伸，共进行次循环扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经染色来检测扩增片段的多态性所用的一系列引物其序列各不相同但对于任一特定的引物它同基因组有特定的结合位点如果这些结合位点在基因组某些区域内的分布符合扩增的条件，就可扩增出片段因此如果基因组在这些区域内发生片段插入、缺失、或碱基突变就可能导致这些特定位点分布发生相应的变化而使PRC产物增加、缺少或发生分子量的改变因此通过对产物的检测即可测出基因组在这些区域的多态性由于进行分析时可用引物数量很大虽然对每个而言其检测基因组多态性的区域是有限的但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组因此可以对整个基因组进行多态性检测1.2 RAPD技术的优点技术一方面继承了PRC效率高、特异性强、样品用量少以及检测容易等特点此外与其它多态性分析方法相比RAPD技术还表现出很多独特的优势和特点：第一，由于RAPD技术引物的设计是随机的，因此可在不知道特异性位点序列信息的情况下，对各种生物进行多态性分析构建其基因指纹图谱；第二， 技术需模扳的量极少每个反应仅需几十纳克；第三，技术操作简便快速可免去其它标记中的克隆制备，多态性筛选，同位素标记等步骤；第四，所用引物均为人工定序合成；第五，每个标记就相当于一个序列位点，故这种方法可以使基因型的检测自动化。1.3 影响RAPD的因素引物的合成是随机的，但要满足 G+C 的含量不低于 40%，引物的长度以 10bp 为佳，引物太短(9bp)易从模板上脱落，聚合反应难以进行;引物的浓度通常是 0.2umol/L，这一浓度足以完成 40 个循环的扩增反应，引物浓度过高可能导致错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者均可竞争酶、dNTP 和引物。但如引物浓度不足，则 PCR 的效率极低，扩增产物的产量太低。4 种 dNTPs 在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。2 实验步骤2.1 实验材料准备一.配制1 M Tris-HCl (pH8.0) 配方:1 M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)(1). 称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中。(2). 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。(3). 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。PH值 浓HCl 7.4 约70ml 7.6 约60ml 8.0 约42ml (4). 将溶液定容至1 L。(5). 高温高压灭菌后，室温保存。二.配EDTA（0.5 mol/l pH8.0）配方: EDTA（0.5 mol/l pH8.0）(1)称取93.06克EDTA2Na2H2O，置于500 mL烧杯中(2)加入约400 mL dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌(3)用NaOH调节pH值到8，约用10克固体NaOH(4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至pH=8(5)加dd H2O将溶液定容到500 ml(6)高温高压灭菌后，室温保存三.1TE Buffer 储存液分装至500mL锥形瓶中，250mL/瓶，分成4瓶。灭菌备用。配方组份浓度 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA（pH8.0）(1). 量取下列溶液，置于1L烧杯中。1 M Tris-HCl Buffer（pH8.0） 10mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 2mL(2). 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。(3). 将溶液定容至1L。(4). 高温高压灭菌，室温保存。将三种的溶液配好后，再统一灭菌，保存。四.准备灭菌水（500 mL蓝盖瓶装）1瓶，黄枪头，蓝枪头，白枪头，进口1.5 mL离心管2盒，普通1.5 mL离心管2盒，普通4 mL离心管2盒，PCR小指管200 l 2盒，灭菌，保存。五.电泳缓冲液： 5TBE（贮存液/L室温保存） 54 g Tris碱 27.5 g硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0） 0.5TBE（工作液）2.2草坪草基因组DNA的提取草坪草提前两至三周种植，当草坪草的生长到了比较茂盛的阶段，即可进行基因组DNA的提取。使用天根新型植物基因组提取试剂盒(DP320)，操作步骤如下：1.处理材料：清洗研钵及研磨棒，晾干或烘干，液氮预冷。取草坪草新鲜叶子组织100 mg 加入液氮充分研磨。加入400 l缓冲液LP1和6 l RNase A（10 mg/ml），漩涡震荡1 min，室温放置10 min。2.加入130 l缓冲液LP2，充分混匀，漩涡震荡1 min。3.12000 rpm（13400 g）离心5min，将上清移至新的离心管中。4.加入1.5倍体积的缓冲液LP3（使用前检查是否已加入无水乙醇），立即充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀。5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm（13400 g）离心30 s，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。6.向吸附柱CB3中加入700 l漂洗液PW（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm（13400 g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。注意：如果吸附柱呈现绿色，向吸附柱CB中加入500 l无水乙醇，12000 rpm（13400 g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7.重复步骤68.将吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm（13400 g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3助于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验）9.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 l洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000 rpm（13400 g）离心2min，将溶液收集到离心管中。10. 将同种植物的4份混合至1个离心管中，标号，封口处加贴封口膜。放入-20冰箱中长期保存，或者直接进行下一步电泳鉴定。2.3草坪草基因组DNA提取情况的电泳验证对于已经提取完毕的基因组DNA，需要对其进行TBE凝胶电泳实验来验证提取情况。在电泳实验之前需要制作TBE胶板，每100 ml的药品用量如下：0.7 g Regular Agarose， 100 ml 0.5TBE电泳缓冲液， 7 l GoldView。如需其他用量则按比例添加。1.称取适量的Regular Agarose至锥形瓶中，加入0.5TBE电泳缓冲液，在微波炉中加热使之溶解。2.待稍冷却后加入适量GoldView，摇匀。将溶液趁热倒入已经组装好的制胶槽中，待胶板彻底冷却后方可使用。3.将胶板放入电泳槽中，加入0.5TBE电泳缓冲液直至没过胶板。4.将草坪草基因组DNA提取液10 l 到离心管中并与1 l Loading Buffer充分混合后逐个加入到胶板的泳道槽中。在第一个泳道槽内加入规格为 DNA/ Hind的DNA Marker 5 l。最后一个泳道槽内加入规格为 DNA/ Hind的DNA Marker 10 l。5.将电泳槽正负极与电泳仪正负极正确相连，注意电泳方向从负极到正极。设定恒定电压为110 V，电泳1 h。6.取出已经电泳完毕的TBE凝胶放入凝胶成像仪（118室）拍摄图像，记录电泳结果。2.4基因组DNA的定量为方便下一步的RAPD-PCR时的加入的样品剂量符合要求，需要将DNA浓度稀释到约100 ng/l，根据TBE凝胶电泳的条带明暗程度确定相应稀释倍数。2.5草坪草DNA的RAPD扩增1.RAPD引物的稀释将RAPD 引物稀释至10 M/l。即从100 M 储备液中吸取20 l 引物溶液，分别加入180 l的超纯水，并且标号作为反应用引物。2.RAPD-PCR反应混合物的制备将以下溶液逐一加入灭过菌的规格为200 l 的PCR专用管中，标号。草坪草基因组DNA（20ng-100ng/l ）1 l RAPD 引物（ 10 M/l） 1 l 2*PCR Mix 12.5 l 超纯水 10.5 l 总体积 25 l 3.RAPD-PCR程序94反应3 min后开始如下循环：94变性反应1 min 36退火反应1 min72延伸反应2 min 经过以上循环45个以后，最后一个循环72 增加5 min，循环结束后，反应产物置于4 保存，如需长期保存则要放入-20 冰箱中保存。4.对PCR产物进行TBE凝胶电泳： 制胶：同前，注意胶浓度：1.5%琼脂糖凝胶加样量：第一个泳道槽内加入规格为D2000的DNA Marker 10 l，其他每个泳道槽加入10 l 反应产物+1l loading buffer电泳：设定恒定电压为110 V，电泳时间40min左右。取出已经电泳完毕的TBE凝胶放入凝胶成像仪（118室）拍摄图像，记录电泳结果。3 实验结果及分析3.1植物总 DNA 的提取草坪草提取DNA电泳图（从左到右依次为：DNA marker，黑麦草，小麦，将军菊苣，荆车草，白三叶，杂三叶，后面的泳道重复前述顺序）本人提取的植物DNA为白三叶DNA，位于第六道和第十三道，从电泳结果来看，DNA提取浓度较高，经过估计，稀释七倍后用于后续多态性 PCR 扩增处理。标准DNA marker 片段电泳结果3.2 植物 DNA 的多态性扩增markD2000D电泳图如下：markD2000电泳图采用131-136六种引物在PCR仪进行扩增，得到如下凝胶电泳图：从左到右看，第1，8，15道为markerD2000，本人所提白三叶DNA位于第6，13道。在引物为131的情况下，白三叶DNA在第6道跑胶，随机扩增效果较好，可以看到六个条带，从上往下看，第一个和第二个条带颜色较浅，含量较少，其中第一个条带为500-750bp之间，第二个条带在500bp左右；第三个和第四个条带比前两个条带亮，但是不及后两个条带亮，含量介于两者之间，其中三号条带略低于250bp，四号条带位于100-250bp之间；第五号和第六号条带很亮，扩增最多，其中，第五号条带略高于100bp，第六号条带低于100bp。总而言之，引物131比较适合白三叶植物的RAPD。在引物为132的情况下，白三叶DNA在第13道跑胶，随机扩增效果过强，条带很亮，可以看到三个明显条带，但是其余条带未明显分离。从上往下看，第一个条带为500bp左右，第二个条带在250bp左右；接下来，从250bp到低于100bp，均有条带出现，但是基本上是连续的，未有明显分离。其中在150bp左右出现最大亮度，明显高于周围，说明此条带扩增最多。总而言之，引物132作为引物时，扩增量大，但是分离不明显，故不太适合白三叶植物的RAPD。上面一排，从左到右看，第1，8，15道为markerD2000，本人所提白三叶DNA位于第6，13道。 在引物为133的情况下，白三叶DNA在第6道跑胶，白三叶DNA基本未有扩增现象出现，仅在100bp附近出现一极不明显条带。所以，引物133不适合白三叶的RAPD。 在引物为134的情况下，白三叶DNA在第6道跑胶，有四条