动物流感检测+a型流感病毒分型基因芯片检测操作规程.pdf

i c s1 1 2 2 0 b4 1 a 雪 中华人民共和国国家标准 g b t2 7 5 3 7 m 2 0 1 1 动物流感检测a 型流感病毒分型基因 芯片检测操作规程 a n i m a li n f l u e n z ad e t e c t i o n m p r o t o c o lo fd n a m i c r o a r r a ye x a m i n a t i o n f o ri n f l u e n z aav i r u ss u b t y p e s 2 0 1 1 11 - 2 1 发布2 0 1 2 0 3 - 0 1 实施 车冒馘繁糯l = t 訾糌瞥霎发布中国国家标准化管理委员会促1 9 刖再 g b t2 7 5 3 7 - - 2 0 1 1 本标准按照g b t1 1 2 0 0 9 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会( s a c t c1 8 1 ) 归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国人民解放军军事医学科学院、中国兽医药品监 察所。 本标准主要起草人：韩雪清、刘伯华、李建、林祥梅、王惹煜、刘建、陈茹、侯义宏、刘业兵、贾广乐、 吴绍强、梁成珠、秦智锋、宁宜宝、薄清如、王伊琴。 1 范围 动物流感检测a 型流感病毒分型基因 芯片检测操作规程 g b t2 7 5 3 7 - - 2 0 11 本标准规定了a 型流感病毒分型基因芯片检测的操作规程。 本标准适用于! l i 岸样品中a 型流感病毒全部亚型( h 1 h 1 6 ，n i n 9 ) 的筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 g b t6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 c t r l 、c t r 2 和c t r 3 ：质控探针1 、2 和3 ( c o n t r o l1 、c o n t r o l2a n dc o n t r o l3 ) d e p c ：焦碳酸二乙酯( d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e ) d n t p ：脱氧核苷酸三磷酸( d e o x y - r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) p b s ：磷酸盐缓冲盐水( p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n ) r n a ：核糖核酸( r i b o n u c l e i ca c i d ) r t p c r ：反转录聚合酶链反应( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) s d s ：十二烷基磺酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) s s c ：氯化钠柠檬酸钠缓冲液( s o d i u mc h l o r i d e - s o d i u mc i t r a t eb u f f e r ) t a m r a ：羧基四甲基若丹明( c a r b o x y t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ) 4 主要试剂和仪器 4 1 主要试剂 4 1 1 试验用水 蒸馏水，按照g b t6 6 8 2 ，三级用水，除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。 4 1 2 提取试剂 t r i z o l 试剂等或商品化的病毒r n a 提取试剂。 4 1 3a 型流感病毒多重不对称r t - p c r 扩增引物和探针的合成 特异性引物和探针( 参见附录a ) 。探针和引物合成后，采用无r n a 酶的水( 参见附录b ) 分别溶解 为5 0 t m o l ，- - 2 0 保存备用。 】 g b t2 7 5 3 7 - - 2 0 ” 4 1 4r t - p c r 反应试剂 一步法r p c r 缓冲液，d n t p ，酶混合物，r n a 酶抑制剂等。 4 1 5 基因芯片 含有a 型流感病毒i 6 个h a 亚型和9 个n a 亚型特异性探针和质控探针，参见附录c 。 4 1 6 基因芯片杂交液 商品化的基因芯片杂交液( 参见附录b ) ，每份含有d d h z o0 7p l ，2 0 s s c1 5p l ， 5 0 d e n h a r d t s1 5v - l ，5 0 ( 质量体积比) 硫酸葡聚糖3 0v l ，4 ( 质量体积比) s d s1 5b t l ，共 8 2p l 份。 4 1 7 杂交质控探针 t a m r a 荧光标记的一段寡核苷酸( c t r l ) ，与芯片上杂交阳性参照( p c ，c t r 2 ) 序列互补，用于质控 杂交过程( 序列参见附录a ) 。合成后，采用无r n a 酶的水溶解为5 0p m o l l ，- - 2 0 保存备用。 4 2 仪器 4 2 1 微型台式高速冷冻离心机( 大于1 30 0 0r m i n ) 。 4 2 2 p c r 仪。 4 2 3 涡旋混匀器。 4 2 4 恒温水浴箱。 4 2 5 芯片杂交盒。 4 2 6 脱色摇床。 4 2 7 基因芯片扫描仪。 4 2 8 冰箱( 2 8 、- - 2 0 和- - 8 0 三种) 。 4 2 9 微量可调移液器。 4 2 1 0 离心管和枪头。 5 操作方法 5 1 采样工具 下列采样工具应经( 1 2 1 + 2 ) ，1 5m i n 高压灭菌并烘干 棉拭子； 剪刀； 镊子； 1 5m l 离心管； 研钵。 5 2 样品采集 5 2 1 活动物 取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下： 取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2 次3 次并旋转，取鼻腔分泌液； 取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮2 次3 次并旋转，取咽喉分泌液 2 g b t2 7 5 3 7 - - 2 0 1 1 取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便； 将采样后的拭子分别放人盛有1 0m lp b s 的1 5m l 离心管中，加盖、编号。 5 2 2 脏器或肌肉组织 用无菌镊子和剪刀等工具采集待检脏器或肌肉组织，装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。 5 3 样品贮运 样品采集后，放人密闭的塑料袋内( 一个采样点的样品放一个塑料袋) ，于保温箱中加冰、密封，2 4h 内送实验室。 5 4 样品的处理 5 4 1 棉拭子处理方法 样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置3 0r a i n ，取上清液转 入无菌的1 5m l 离心管中，编号备用。 5 4 2 肌肉或组织脏器处理方法 取待检样品2 0g ，加入等量灭菌石英砂，于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加入1 0m lp b s 混匀，4 ，30 0 0r r a i n 离心1 5r a i n ，取上清液转入无菌的1 5m l 离心管中，编号备用。 5 5 样品r n a 的制备 5 5 1 取上清液2 0 0p l ，分别加入1 5m l 离心管内，各加入t r i z o l 试剂1 0m l ，反复混匀，冰上放置 5 m i n 。 5 5 2 加入2 0 0p l 氯仿，小心盖上帽盖，用力摇动离心管1 5s ，室温放置5m i n 。 5 5 3 1 20 0 0r m i n ，4 ，离心1 5r a i n ，可见分为三层，上层水相含r n a 。 5 5 4 转移水相至一新离心管内，加入等量异丙醇，混匀，室温放置1 5r a i n 。 5 5 51 20 0 0r r a i n ，4 ，离心1 0r a i n ，离心后在离心管边和底部可见有胶样r n a 沉淀( 对于细胞毒 而言，可能看不到沉淀) 。 5 5 6 小心吸弃上清，加入5 0 0p l7 5 乙醇( 用d e p c 水配制) ，小心颠倒以漂洗沉淀及管壁， 1 20 0 0r m i n ，4 ，离心5m i n 。 5 5 7 小心吸弃上清，室温干燥r n a 沉淀5m i n 1 0m i n 。然后加入2 0p l 无r n a 酶的水溶解沉 淀。提取的r n a 应在2h 内进行r t - p c r 扩增，若需长期保存，应放置- - 8 0 冰箱保存。 5 6a 型琉感病毒r n a 多重不对称r t - p c r 扩增体系 5 6 1 引物混合比例 2 5 对引物分为4 组。第1 组包括h 1 、h 3 、h 5 、h 6 、h 7 、h 9 、n 1 和n 2 ，其中h 5 和h 7 亚型的上游 引物为0 6 5p l ，下游引物为1 3p l ，n 2 亚型的上游引物为0 6p l ，下游引物为1 2 乩，其余亚型的上 游引物均为0 5p l ，下游引物均为1p l ；第2 组包括h 2 、h 4 、h 8 、h 1 0 、h l l 、h 1 3 、h 1 5 和h 1 6 ，每个亚 型的上游引物均为0 5p l ，下游引物均为1p l ；第3 组包括h 1 4 、n 4 、n 6 、n 7 和n 9 ，其中n 7 上游引物 为0 6 5p l ，下游引物为1 _ 3p l ，其余亚型上游引物均为0 5g l ，下游引物均为1p l ；第4 组包括h 1 2 、 n 3 、n 5 和n 8 ，其中n 5 上游引物为0 6p l ，下游引物为1 2p l ，其余亚型上游引物均为0 5g l ，下游 引物均为1g l 。 5 6 2r t - p c r 反应体系 每个样品分4 个管进行r t - p c r 。在0 2m lp c r 反应管中依次加入一步法r t p c r 缓冲液 g b t2 7 5 3 7 - - 2 011 1 0p l ，1 0m m o l ld n t p2 0g l ，酶混合物2 0v l ，r n a 酶抑制剂0 5p l ，通用引物上游0 5p l 、下 游5 0p l ，r n a 模板5 0p l ，按照4 组引物混合物的用量分别加入引物混合物，补无r n a 酶的水至 5 0 0p l 。置于p c r 仪立即进行r t - p c r 扩增。 5 7a 型流感病毒多重不对称r t - p c r 反应条件 反应条件：5 0 3 0m i r a 9 5 1 5m i r a 9 4 2 0s ，5 2 6 05 ，7 2 9 0s ，共2 0 个循环；然后9 4 2 0s ，7 0 9 0s ，共2 0 个循环；最后7 2 延伸1 0r a i n 。扩增反应结束后，取出放置于4 。 5 8 基因芯片的杂交、洗涤与扫描 5 8 1 杂交步骤 5 8 1 1 扩增产物5 2v l ( 4 组r t - p c r 产物各取1 3p l ) 、杂交质控探针0 8p l 和杂交液6p l 于 0 zm lp c r 管中，混匀。 5 8 1 29 5 变性5r a i n ，立即冰浴3m i n ，40 0 0r r a i n 离心5s 1 0s ，将离心管放回冰浴。 5 8 1 3 在杂交盒的沟槽中加入2 0 0p l 蒸馏水以防止杂交体系蒸发，将芯片正面向上放人盒中。 5 8 1 4 将已变性的杂交样品从冰盒中取出，用枪头轻轻吹吸3 次5 次。 5 8 1 5 取7 “l 杂交混合液加到探针点阵区，迅速盖上益片和杂交盒并密封。 5 8 1 6 将杂交盒水平放人5 2 的水浴锅中，杂交2 5h 。 5 8 2 洗涤步骤 5 8 2 1 杂交结束后，立即将芯片取出，放人预热至4 5 的洗涤液i 中，1 0 0r r a i n 水乎振荡洗涤 5r a i n ，相同条件重复一次。 5 8 2 2 取出芯片，放人预热至4 5 的洗涤液中，1 0 0r r a i n 水平振荡洗涤5m i n ，相同条件重复 一次。 5 8 2 3 取出芯片，放人洗液中，1 0 0r r a i n 室温振荡5 r a i n 。 5 8 2 4 将芯片在无水乙醇中浸提几次，然后把芯片放人芯片盒中，10 0 0r r a i n 离心5m i n 。 5 8 3 扫描 用基因芯片扫描仪( 波长5 3 2n m ，p m t 6 0 ，激光能量9 0 ，扫描仪参数不作硬性规定) 进行芯片 扫描。 6 结果判定 6 1 检测结果成立条件 a 型流感病毒基因芯片点样阳性参照( q c ，即c t r 3 ) 和杂交阳性参照( p c ，即c t r 2 ) ，经杂交扫描后出 现特异性荧光信号，同时点样b u f f e r 参照( n c ) 和空白参照( n ) 无荧光信号，则检测结果成立，否则结果 不成立，应重新试验。 6 2 结果判断 6 2 1 阳性判定 在试验结果成立的前提下，如果样品r t - p c r 产物经杂交后，在各自的位置上( 见图1 ) 出现特异性 4 g b t2 7 5 3 7 - - 2 01 1 荧光信号，则判定为a 型流感病毒各个亚型( 包括h a 和n a ) 核酸阳性。每条探针有2 个重复位点，出 现2 个或2 个以上荧光信号者判为该亚型核酸阳性；出现1 个荧光信号需进行重复试验再次读判，如果 仍出现1 个荧光信号，就判为可疑，可采用其他方法进一步验证。如果只有h a 或者只有n a 位点出现 荧光信号，或者2 个以上h a 或n a 亚型位点出现荧光信号，都判定为该亚型核酸阳性。 q cq ch 1h 1h 1h 1n cn ch 1h 1h 2h 2 q cq c h 2h 2h 3h 3h 3h 3h 4h 4h 4h 4h 5h 5h 5h 5 h 6h 6h 6h 6h 7h 7h 7h 7h 7h 7h 7h 7h 8h 8 h 8h 8 h 9 h 9h 9 h 9 h l oh 1 0 h 1 0 h 1 0 h 1 1h 1 1h 1 1h 1 1 n cn c h 1 2h 1 2 h 1 2 h 1 2p c p c h 1 3h 1 3h 1 3h 1 3n cn c h 1 4h 1 4 h 1 4h 1 4h 1 5h 1 5h 1 5 h 1 5 h 1 6h 1 6h 1 6h 1 6n 1n 1 n 1n 1n 2n 2n 2n 2n 3n 3n 3n 3n 4n 4n 4n 4 n 5n 5n 5n 5n 6n 6n 6n 6n 7n 7n 7n 7n 8n 8 q cq cn 8n 8n 9n 9n ( ：n cn 9n 9nn q cq e q c 点样阳性参照； p c 杂交阳性参照； n c 点样b u f f e r 参照； n 空白参照 d p ( h 1 h 1 6 ，n 1 n 9 ) 检测探针 图1 芯片探针排布图 6 2 2 阴性判定 如果在各亚型特异性探针位置上( 见图1 ) 均未出现荧光信号，则判定为a 型流感病毒亚型核酸阴性。 7 注意事项 7 1 样品处理、r n a 提取和r t - p c r 加模板等操作应该符合相关生物安全操作管理规定的要求，同 时注意自身防护。扩增后芯片杂交检测可在普通实验室进行操作。 7 2 因涉及r n a 操作，为了防止r n a 降解，用于试验的器皿和离心管、p c r 管及枪头等均需要用 d e p c 水处理，并经过1 2 1 、1 5m i n 高压灭菌后才可使用。操作时应戴一次性手套，并经常更换。 7 3 模板r n a 提取、p c r 反应液配制、芯片杂交、芯片洗涤和结果观察等应分区或分室进行，实验室 运作应从洁净区到污染区单方向进行。 7 4 当同时需要进行数个样品的多重不对称r t p c r 反应时，先配制除待检样品外的各种试剂的混 合液，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同 一试剂。同时也可以减少实验操作产生的误差。 7 5 使用酶混合物和r n a 酶抑制剂等酶类时，取样之前要瞬时离心，将液体收集到反应管底部；由于 酶保存液中含有5 0 的甘油，黏度高，应慢慢吸取以保证取样量的准确。 7 6 上机运行前应检查各p c r 管盖是否盖紧，以防r n a 和p c r 产物污染仪器。 7 7 取杂交混合液加到探针点阵区时，一定要轻柔，避免出现气泡，否则会影响杂交结果。 7 8 5 2 杂交时，杂交盒要水平放置。 7 9 芯片洗涤时，洗涤液i 和洗涤液要预热，否则洗涤不干净，影响扫描结果。 7 1 0 芯片常温避光保存。 g b t2 7 5 3 7 - - 2 01 1 附录a ( 资料性附录) 引物和探针序列 表a 1a 型流感病毒基因芯片多重不对称r t - p c b 引物 型别引物编号序列( 5 3 ) 长度 u 1 1 i v _p m a 一0 6 0 0 1 一u ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g e r s a lp m a 一0 6 0 0 2 一u ot a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t h 1p m a 一0 6 0 0 2 h 1 f t c a c t t g c r t c c g t t g a g g g g a g c a a t t g a g t t c a g t a t c6 0 1b p p m a 一0 6 0 0 4 一h 1 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t g a c a c t c t c c t a t t g t g a c t g h 3 p m a 一0 6 0 0 5 一h 3 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g t g t t a c c c t t a t g a t g t g c c6 5 9b p p m a 一0 6 0 0 6 一h 3 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t c c c t g t t g c c a a t t t c a g a g h 5p m a 一0 6 0 0 7 一h 5 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g a g t g a a t t g g a a t a t g g t a a c t g 3 8 0b p p m a 一0 6 0 0 8 一h 5 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t a a c t g a g t g t t c a t t t t g t c a a t h 6p m a 一0 5 0 1 7 - h 6 f t c a c t t g c t t c c g t t g a g g a a g g c a c t t a t t g g r t c a g g6 8 5b p p m a 一0 6 0 1 8 一h 6 r t a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t g t c c t c t a g t t t c a a t c t g t g g h 7p m a 一0 6 0 0 9 一h 7 f t c a c t t g c t t c c g t t g a g ( 汀c a g g w t c t t c w t t c t a t g c6 4 1b p p m a 一0 6 0 1 0 一h 7 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t t c y c c t t g t g c a t t t t g a t g h 9 p m a 一0 6 0 1 1 - h 9 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g a a g a g a a t g g t c c t a c a t c g t4 9 3b p p m a 一0 6 0 1 2 一h 9 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t g g a t c t t a c t c g c a a t g t c t g n 1p m a 一0 6 0 1 3 一n 1 ft c a c t t g c t t o c g t t g a g g t c c c a c t t g g a a t g c a g a a c 3 2 8b p p m a 一0 6 0 1 4 一n l r t a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t c a c a t g c a c a t t c a g a c t c t t g n 2p m a 一0 6 0 1 5 一n 2 f t c a c t t g c t t c c g t t g a g g a t a g c a t g g t c c a g c t c a a g2 9 9b d p m a 一0 6 0 1 6 n 2 r t a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t a c a t g c t g a g c a c t t o c t g h zp m a 一0 6 0 1 9 一h 2 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g c ( ；t c a t t c t t c a g g 从c a t g g 2 2 9b p p m a 一0 5 0 2 0 - h 2 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t g g c c t t g t t g c t a t t t c w g g h 4 p m a 0 6 0 2 1 - h 4 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g t t g t t a y c c a t t t g a t g t g c c3 2 4b p p m a 一0 5 0 2 2 一h 4 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t g t r a c t c t t c c a g g g t t g t t h 8p m a - 0 5 0 2 3 一h 8 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g a a g g t t g g t c a t a c a t a g t g g 4 4 4b d p m a 一0 6 0 2 4 一h 8 r t a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t c ；t c c t c t t a c t a a t g ( ；t c t g g h 1 0p m a 一0 6 0 2 5 一h 1 0 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g g a t t g a c a a g a t a a g c a c c g g 4 3 5b p p m a - 0 6 0 2 5 一h 1 0 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t t t a c t y a c t c t a c t a g g t g c t a t h 1 1p m a - 0 6 0 2 7 一h 1 1 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g a c t t a g a a a t g t c o c a g c a a 4 3 7h p p m a - 0 6 0 2 8 一h i l rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t c a t t t c c c t c g t c t t t g g c h 1 2p m a 一0 6 0 3 5 h 1 2 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g a g t a c a a g a a c a c c a g a g a t t 5 3 7b p p m a - 0 6 0 3 6 一h 1 2 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c ( 汀c t g g c c a t c c g c c t t c t a t h 1 3p m a - 0 6 0 2 9 一h 1 3 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g g a c c c t t c t g c t c c t c a t g 4 7 4b p p m a 一0 6 0 3 0 一h 1 3 rt a m r ag g t t t c g g a t g t t a c a g c g t g a a a c t g a t t g a t t c c c c t g g h 1 4p m a - 0 6 0 3 7 - h 1 4 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g t c t c c c g a c t a a a c t g g c t a 2 4 7b p p m a 一0 6 0 3 8 一h 1 4 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t c t g c c g c t c t g a t t c c t t a c 6 表a 1 ( 续) g b t2 7 5 3 7 - - 2 0 1 1 型别引物编号序列( 5 3 )长度 h 1 5p m a 0 6 0 3 1 - h 1 6 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g g a c t c c t t g a c t g a g a t c t g g 3 0 5h p p m a - 0 6 0 3 2 一h 1 5 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t a g t a t c a c a t c t t t g t a c c c a c h 1 6p m a 一0 6 0 3 3 一h 2 6 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g t a a a c t t c t c g t g e t a a t c g 2 5 2b p p m a 一0 6 0 3 4 一h 1 6 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t g t c t t c a a c t t g a t c c c t t c n 3 p m a 一0 6 0 4 9 一n 3 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g g g g a a a g a r t g g a t g c a t g t3 6 6b p p m a 一0 6 0 5 0 - n 3 rt a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t g t t g t t g a t t c t c a t c c a a g g n 4p m a 一0 6 0 3 9 一n 4 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g g g a a g c a a t c g a c c a t g g a t2 6 0h p p m a 一0 6 0 4 0 一n 4 r t a m r a g g t t t c c - g a t g t t a c a g c g t c g a c a c c c a t c c a t t a g c a t n 5p m a 一0 6 0 5 1 一n 5 ft c a c t t g c t t c c g t t g a g g a c t g t t a t t g g g t a a t g a c g4 5 9h p p m a 一0 6 0 5 2 一n 5 r t a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t t g c t t g t t t t g g t c c a a c c g n 6p m a 一0 6 0 4 1 一n 6 f t c a c t t g c t t c c g t t g a g g a c c t a a t a a c a a t g c t t c g g2 4 6b d p m a 0 6 0 4 2 一n 6 r t a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t c a ( ：t c t t c t a t a t g c t g t g c n 7p m a 一0 6 0 4 3 一n 7 f t c a c t t g c t t c c g t t g a g g t g t g c a g a g a t a a y t g g c a3 5 2b p p m a - 0 6 0 4 4n 7 r t a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t c c g g a a t a g c c t g a c c a a t t n 8 p m a 一0 6 0 4 5 一n 8 ft c a c ”g c t t c c g t t g a o g g g o c a m t g a t g t a t g g a t g g3 4 0b p p m a 一0 6 0 4 6 一n 8 rt a m r a - g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t a a g a a t a g c t c c a t c g r g c c n 9 p m a 一0 6 0 4 7 一n 9 ft c a c t t g c i t c c g t t g a g g t t c t a t g c t c t c a g c c a a g g3 1 0h p p m a 一0 6 0 4 8 一n 9 r t a m r a g g t t t c g g a t g t t a c a g c g t t g g c a t a c g c a t t c a g a t t c 注：y = ( c ，t ) ，w = ( a 。t ) 。r = ( a ，g ) 表a 2a 型流感分型基因芯片探针 型别编号 探针序列( 5 3 ) 质控探针q c p p b a 一0 8 0 0 1 - c t r lt a i v i r a - c c t c a a c g g a a g c a a g t g a t p b a 一0 8 0 0 2 一c t r 2n h 2 一t 1 5 一a t c a c t t g c t t c c g t t g a g g p b a 0 8 0 0 3 一c t r 3n h 2 一g c t ( ；c c t c g g c a a g g a g t t a m r a h 1 p b a 一0 8 0 0 4 - h l an h 2 一t 1 5 一t g c t t a t g t c t c t g t a g t g t c t t c p b a 一0 8 0 6 6 - h i dn h 2 t 1 5 一a a t a g a a c c t g g a g a c a c a a t a a p b a - 0 8 0 6 8 一h 1 1n h 2 一t 1 5 一c g a g a t a t t c c c c a a g a c a a g t t h 3p b a 一0 8 0 0 7 一h 3 a n h 2 一t 1 5 一c c t c g g g g t t a c t t c a a a a t a c g p b a 一0 8 0 0 8 一h 3 b n h 2 一t 1 5 一g g a a g c a t t o c c a a t g a c a a a c c h 5 p b a 0 8 0 i 1 - h 5 an h 2 一t 1 5 一g t c a c c a a t a a g g t c a a c t c g a t c p b a - 0 8 0 1 2 - h 5 bn h 2 一t 1 5 一a c c a t a g c a a t g a g c a g g g g a h 6 p b a 一0 8 0 2 5 一h 6 an h 2 一t 1 5 一t g a g a t g t t t c c c a a a a g t a c a t g g p b a 一0 8 0 2 6 一h 6 bn h 2 一t 1 5 一a t g g g a a c t g a a a g c a t g a a t t t h 7 p b a 一0 8 0 1 3 一h 7 an h 2 - t 1 5 一c a g a c c a a a c t c t a t g g a a g t g g a p b a 一0 8 0 1 4 一h 7 bn h 2 一t 1 5 一( y r c a a a c a c a g a c a a t o c t g c t t p b a 一0 8 0 6 5 - h 7 e n h 2 一t 1 5 一c a a g g a a a g a c c c a g c t c t g a t a a t h 9p b a - 0 8 0 1 7 一h 9 a n h 2 一t 1 5 一c a a g a c g c c c a a t a c a c a a a t a a t p b a 一0 8 0 1 8 一h 9 b n h 2 一t 1 5 一a a g c a t g t t c a g a t t c a t t c t a c a g 7 g b t2 7 5 3 7 - - 2 011 表a 2 ( 续) 型剐编号探针序列( 5 3 ) n 1p b a 一0 8 0 1 9 - n l an h 2 一t 1 5 一a g t t g g t t g a c a a t t g g a a t t t c t g p b a 一0 8 0 2 0 - i n l bn h 2 一t 1 5 一c a a g a g t t g g a g g a a c 从c a t a c t n 2p b a 一0 8 0 2 2 一n 2 an h 2 一t 1 5 一g c g t t t g t a t c a a t g g a a c t t g t a p b a 一0 8 0 2 3 一n 2 bn h 2 一t 1 5a t g a t g g g a a a g c a t g g t t a c a t g h 2p b a 一0 8 0 2 7 一h 2 a n h 2 一t 1 5 一a c a t c a a c a c t g a a t a a g a g g t c p b a 一0 8 0 2 8 一h 2 bn h 2 一t 1 5 一g a a c a a a g g a c a c t g t a c c a g a a t h 4p b a 一0 8 0 2 9 一h 4 an h 2 一t 1 5 一g a c a a a g g t c a a c a a t g g g g a p b a 一0 8 0 3 0 一h 4 bn h 2 一t 1 5 - c t t c a a c t g a c g c a g a a c a 从 h 8p b a 一0 8 0 3 i - h 8 an h 2 一t 1 5 一t g g a g a c a t c a t t t t c t t a t g g g p b a 一0 8 0 3 2 一h 8 bn h 2 一t 1 5 一g c a t c t t a c a a g a g a a t a a g g c t a t t h 1 0p b a 一0 8 0 3 4 一h 1 0 an h 2 一t 1 5 一a a a a c a a c t t t g t g c c t g t g g t p b a 一0 8 0 3 5 一h 1 0 b n h 2 一t 1 5 一c a c a a g a a a a g a a t g a t c t g t a t g g h 1 1 p b a 一0 8 0 3 6 一h 1 1 an h 2 一t 1 5 一c a g t g a a a t a g a g g a g a g g a t a a a c c p b a 0 8 0 3 7 一h 1 l bn h 2 一t 1 5 一a g a a g g a t g c t a a a g g a c a a t g h 1 2 p b a 一0 8 0 4 5 一h 1 2 an h 2 一t 1 5 一t a a t c a c a g g g a a a t c a c a t g g c p b a 一0 8 0 4 6 一h 1 2 bn h 2 一t 1 5 一c a c t a g t a a g c a c t a t a t t g g g a a h 1 3p b a 一0 8 0 3 8 + h 1 3 an h 2 一t 1 5 一g g a t g a a g a t t t a c t g g t a t t t g a t g p b a 一0 8 0 3 9 一h 1 3 bn h 2 一t 1 5 一g t t c a t g g a g t a g g a a a t a c a a c c h 1 4p b a 一0 8 0 4 7 一h 1 4 an h 2 一t 1 5 一c c a t c a a g c g a t a a t g a g c a a a c p b a 一0 8 0 4 8 一h 1 4 bn h 2 一t 1 5 一t c t t a t g t c a g g c t c t a t c t c t g g h 1 5 p b a 一0 8 0 4 0 一h 1 5 an h 2 一t 1 5 一g c a t a c a a t t g a c c t t g c a g a t t c p b a 一0 8 0 4 1 一h 1 5 bn h 2 一t 1 5 一c c g a t g t g a c g a t c a a t g t a t g h 1 6 p b a 0 8 0 4 3 一h 1 5 bn h 2 一t 1 5 一g a c a g a a c a t t a g a c c t g c a t g a t p b a 一0 8 0 4 4 一h 1 5 cn h 2 一t 1 5 一a t c a t g a g g a c t a c a a a g a a g a g n 3p b a 一0 8 0 4 9 一n 3 an h 2 一t 1 5 一t a t g t a g g g a c a a t t g g a a g g g p b a 一0 8 0 5 0 一n 3 bn h 2 一t 1 5 一g a t a a t g a t g c a a g t g c c c a g a n 4p b a 一0 8 0 5 1 - n 4 an h 2 一t 1 5 一g g c t a t g t a t g t a g t g g g a t a t t t g p b a 一0 8 0 5 2 一n 4 b n h 2 一t 1 5 一g a t g g c a c a g g c t c a t g t a a t a g n 5 p b a 一0 8 0 5 3 - n 5 an h 2 一t 1 5 一g t t t g c c g a g a t a a t t g g a a t g g p b a 一0 8 0 5 4 一n 5 bn h 2 一t 1 5 一a g g g a g g t c a c a t t g a a g a ( 玎 n 6 p b a 一0 8 0 5 5 一n 5 an h 2 一t 1 5 一g g c a g g a a a t a t a t t a a g g a c t c a p b a 一0 8 0 5 6 一n 6 bn h 2 一t 1 5 c c a g c t a a t a a c a g a g c a g a a a c n 7p b a 一0 8 0 5 7 一n 7 an h 2 一t 1 5 一a t g t t g a a a a t a c c t a a t g c a g g p b a 一0 8 0 5 8 一n 7 bn h 2 一t 1 5 一a a g g g a t t c g g g t t