中药中桔青霉素检测方法的研究.pdf

独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名巷 加1 年伽j 妒 簟。 恕 学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致， 允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国 学位论文全文数据库并向社会提供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂 志社将本论文编入中国优秀搏硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。 论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于 不保密o 。 学位论文作者签名：崔 加、1 年f 分类号 基窆量兰：2 u d c 主垒2 密级坌珏 编号1 0 2 9 9 s 0 8 1 5 0 1 1 江薄大擎 硕士学位论文 中药中桔青霉素检测方法的研究 s t u d y o nt h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d so f c i t r i n i ni n t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e s 指导教师眍5 旦臻教撞扬差堡瑟究员 作者姓名奎葱 申请学位级别亟 学科( 专业)生药堂 论文提交日期2 q 羔! 生5 月论文答辩日期2 q 羔羔生鱼自 学位授予单位和日期江苤太堂2 q ! 羔生鱼且 答辩委员会主席 评阅人 江苏大学硕士学位论文 摘要 桔青霉素( c i t r i n i n ) 是青霉属( p e n i c i l l i u m ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、红曲霉属 ( m o n a s c u s ) d p 的丝状霉菌代谢产生的一种真菌毒素，在自然界中分布极其广泛。 桔青霉素有致畸、致癌、致突变的潜在危害，而且还与某些地方性疾病的发生有 密切联系，对人畜健康的危害十分严重。鉴于桔青霉素在食品、农产品中的普遍 性和危害性，特别是近年来国内市场上红曲产品中桔青霉素的污染普遍性，大大 影响了人们的身体健康和红曲产品的出口贸易，因此应继续加强红曲产品中桔青 霉素检测方法的建立和相关限量标准的完善，以保证食品安全。此外，应当重视 的是，传统药用植物与农产品、饲料相比，在生长、收获、运输和贮藏期间同样 存在被产毒霉菌污染的可能性，因此很有必要建立一套中药中桔青霉素的检测方 法，制订其合理的限量标准，以保证中药的安全有效。国内外对桔青霉素建立了 多种检测分析方法，但这些分析方法只限于对食品、农产品以及饲料中毒素的分 析，对中药中桔青霉素的分析，涉及还比较少。本文建立了红曲产品以及中药中 桔青霉素的检测方法。主要研究内容和结论如下： 1 、建立了红曲及其制品中桔青霉素的高效液相色谱检测方法及质谱确证方 法，并对国内市场上红曲样品进行了污染状况调查。 红曲样品经甲醇一水( 7 0 ：3 0 ，v v ) 混合溶剂提取，通过桔青霉素免疫亲和柱 ( i a c ) 净化，采用h p l c f l d 测定，并对测定结果进行l c m s m s 确证。该 法检测限为0 8p g k g ，线形范围为0 1 - 1 0 0 0n g m l ，在2 5 2 0 0i i 班g 添加水平下， 回收率范围在7 3 4 8 9 4 ，相对标准偏差范围为2 1 7 9 。对国内市场上5 9 批红曲样品进行了分析测定，调查显示其中有2 9 批样品检测为阳性，污染水平 为1 6 6 2 5 2 5 2 9 0 t g k g ，该方法简单、准确、可靠，可用于红曲及其制品中桔青 霉素的检测分析。 2 、建立了中药材及其制品中桔青霉素的高效液相色谱检测方法，并对国内 中药市场的中药样品进行了污染状况调查。 中药样品经甲醇水( 7 0 ：3 0 ，v v ) 混合溶剂提取，通过桔青霉素免疫亲和柱 ( i a c ) 净化，采用h p l c f l d 测定。该法检测限为0 8 t e d k g ，在2 5 2 0 0 g k g 添加水平下，不同基质中药的回收率范围在7 9 2 9 2 5 ，相对标准偏差范围 中药中桔青霉素检测方法的研究 1 4 4 8 。对国内市场上5 0 批中药样品进行了分析测定，在该检测限以上没有 样品含有桔青霉素。该方法简单、准确、可靠，可用于中药中桔青霉素的检测分 析。 3 、建立了中药中桔青霉素的高效液相色谱串联质谱检测方法。 样品经甲醇水( 7 0 ：3 0 ，v v ) 混合溶剂提取后，通过桔青霉素免疫亲和柱( i a c ) 净化，采用l c m s m s 法测定中药中的桔青霉素。质谱采用电喷雾电离( e s i ) ， 多反应监测( m r m ) 方式分别监测离子对m z2 5 1 _ m z2 3 3 ( 桔青霉素) 和m z 4 7 2 _ m z4 3 6 ( p 勺标特非那定) 。以桔青霉素和内标特非那定峰面积的比值对桔青 霉素的浓度作线性回归，桔青霉素在0 1 5 0n g m l _ 旅度范围内线性关系良好，日 内和日间精密度以r s d 表示均低于5 4 4 ，方法的定量限为2 5 “班g ，平均回收 率在8 1 2 9 3 3 范围内。对2 8 批包含中药材红曲米在内的中药样品进行了分析 测定，有6 批样品检出桔青霉素阳性，污染水平在8 5 5 3 5 7 5 雌肚g 。该方法快速、 灵敏，结果准确，适用于复杂中药基质中桔青霉素的检测。 关键词：中药，红曲，桔青霉素，高效液相色谱，质谱 i i 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t c i t r i n i ni sas e c o n d a r yt o x i cm e t a b o l i t ep r o d u c e db ys e v e r a lf i l a m e n t o u sf u n g io f t h eg e n e r ap e n i c i l l i u m ，a s p e r g i l l u sa n dm o n a s c u s ，a n df o u n di nag r e a tv a r i e t yo f f o o d s t u f f sa n da g r i c u l t u r a lp r o d u c t s i t sp r e s e n c ei sar i s kf o rt h eh u m a na n da n i m a l h e a l t h ，s i n c et h e ym a yl e a dt od e f o r m i t y , c a n c e r ，a n dm u t a t i o n m o r e o v e r , c i t r i n i nh a s b e e nc o n s i d e r e da sap o t e n t i a lr i s kf a c t o ro fh u m a nb a l k a ne n d e m i cn e p h r o p a t h y ( b e n ) o r i g i n a l l yd e s c r i b e da sac h r o n i ct u b u l o i n t e r s t i t i a lk i d n e yd i s e a s e d u et ot h e h i g ht o x i c i t ya n dg r e a td i f f u s s i o no fc i t r i n i n ，e s p e c i a l l yi nr e dy e a s tr i c ea n dr e l a t e d p r o d u c t s ，t h ee x p o r tt r a d eo fr e dy e a s tr i c es u f f e r sc o n s i d e r a b l el o s s e s t h e r e f o r e ，t h e m e t h o d so fd e t e r m i n a t i o ni nr e dy e a s tr i c es h o u l db ee s t a b l i s h e di m m e d i a t e l yi no r d e r t oe n s u r et h ef o o ds a f e t y i na d d i t i o n ，l i k ec e r e a l sa n do t h e rf o o d s t u f f s ，m e d i c i n a l p l a n t sm a yb ec o n t a m i n a t e db yt h o s ef u n g ip r o d u c i n gc i t r i n i nd u r i n gt h ep r o c e s so f g r o w t h ，h a r v e s t ，t r a n s p o r t a t i o na n ds t o r a g e ，a n dc i t r i n i nm a ya l s ob ef o u n d i nt h ef i n a l p r o d u c t s a sar e s u l t ，i ti sa l s ov e r yi m p o r t a n tt od e v e l o ps o m ea n a l y t i c a lm e t h o d sf o r t h ed e t e r m i n a t i o no fc i t r i n i ni nt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e ( t c m ) i no r d e rt o e v a l u a t ei t s p o t e n t i a lh a z a r dt oh u m a nh e a l t h m a n yd i f f e r e n tm e t h o d sf o rt h e d e t e r m i n a t i o no fc i t r i n i nh a v eb e e np u b l i s h e d b u ta l lo ft h e s ea n a l y t i c a lm e t h o d s h a v e b e e nc o n c e n t r a t e dm a i n l yo na g r i c u l t u r a lp r o d u c t s ，f o o d sa n df e e d s i nt h i st h e s i s ， s o m em e t h o d sh a db e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc i t r i n i ni nr e dy e a s tr i c e a n d t c m t h em a i nc o n t e n t sa n dc o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： 1 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m e t h o da n dm a s s s p e c t r a i d e n t i f i c a t i o nm e t h o dw e r ee s t a b l i s h e dt oa n a l y z ec i t r i n i ni nr e dy e a s tr i c e as i m p l e ，a c c u r a t ea n dr e l i a b l em e t h o dw a sd e v e l o p e da n dv a l i d a t e df o rt h e d e t e r m i n a t i o no fc i t r i n i ni nr e dy e a s tr i c eu s i n gh p l c - f l d ，a n dt h ep o s i t i v er e s u l t s w e r ec o n f i r m e db yl c m s m s t h es a m p l ew a se x t r a c t e dw i t hm e t h a n o l h e o ( 7 0 ：3 0 ， v v ) ，f o l l o w e db yc l e a n u po ft h ee x t r a c tw i t hi m m u n o a f f i n i t yc o l u m n c a l i b r a t i o n c u r v ew a sf o u n dt ob el i n e a rw i t ht h er a n g eo f0 1 - 1 0 0 0n g m l r e c o v e r i e ss p i k e d w i t hc i t r i n i na tl e v e l sr a n g i n gf r o m2 5t o2 0 0 i _ t g k gw e r ef r o m7 3 4 t o8 9 4 ，w i t h r e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s ( r s d s ) r a n g i n gf r o m2 1 t o7 9 t h el i m i to fd e t e c t i o n w a s0 8 g k g ，b a s e do n as i g n a l t o - n o i s er a t i oo f3 ：1 o u to fat o t a l5 9r e dy e a s tr i c e s a m p l e sm a r k e t e di nc h i n a ，c i t r i n i nw a sf o u n di n2 9s a m p l e s ，r a n g i n gf r o m1 6 6 2 1 i i 中药中桔青霉素检测方法的研究 l 上g k gt o5 2 5 2 9 0 g a g t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ed e v e l o p e dh p l c - f l dm e t h o d c a nb er e a d i l yu t i l i z e da sac i t r i n i nd e t e c t i n gm e t h o df o rr e dy e a s tr i c ea n di t sr e l a t e d p r o d u c t s 2 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym e t h o dw a se s t a b l i s h e dt oa n a l y z e c i t r i n i ni nt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e h p l c - f l dh a sb e e ne m p l o y e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc i t r i n i ni nt r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n e s ( t c m ) f o rt h ef i r s tt i m e t h i sm e t h o dc o n s i s t so fe x t r a c t i o no ft h e s a m p l ew i t hm e t h a n o l - h 2 0 ( 7 0 ：3 0 ，v v ) f o l l o w e db yc l e a n u po ft h ee x t r a c tw i t h i m m u n o a f f i n i t yc o l u m n r e c o v e r i e sf r o md i f f e r e n tt c m ss p i k e dw i t hc i t r i n i na t l e v e l sr a n g i n gf r o m2 5t o2 0 0 g a gw e r ef r o m7 9 2 - 9 2 5 ，w i t hr e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n s ( r s d s ) r a n g i n gf r o m1 4 t o4 8 t h el i m i to fd e t e c t i o nw a s0 8l 土g k g ， b a s e do nas i g n a l - t o - n o i s er a t i oo f3 ：1 t h em e t h o dd e v e l o p e dh a sb e e nu s e dt o d i f f e r e n to r i g i n a lt c m sp u r c h a s e df r o mt h em a r k e t s ( n = 5 0 ) ，a n dn o n eo ft h es a m p l e s c o n t a i n e dc i t r i n i na b o v et h ed e t e c t i o nl e v e l t h e p r o p o s e dm e t h o d h a sb e e n s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e r m i n e c i t r i n i ni nt c mw i t hs a t i s f a c t o r ya s s a yr e s u l t s 3 l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y - t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r ym e t h o dw a s e s t a b l i s h e dt o a n a l y z ec i t r i n i ni nt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e l c m s m sm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc i t r i n i ni nt r a d i t i o n a lc h i n e s e m e d i c i n e s ( t c m ) w a se s t a b l i s h e d c i t r i n i ni n t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e sw a s e x t r a c t e db y7 0 m e t h a n o l ，a n dt h e np u r i f i e db yi m m u n o a f f i n i t yc o l u m n t h em a s s s p e c t r o m e t e rw a so p e r a t e di nt h ep o s i t i v ei o n i z a t i o ne l e c t r o s p r a y ( e s i ) m o d eu s i n g m u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r i n g ( m r m ) t h et r a n s i t i o n sm z 2 51 - - - m z 2 3 3 ( c i t r i n i n ) a n d m z 4 7 2 - - * m z 4 3 6 ( t e r f e n a d i n e ，i n t e r n a ls t a n d a r d ) w e r eu s e dt oq u a n t i f yc i t r i n i n t h e m e t h o dh a ds a t i s f a c t o r y l i n e a r i t y i nt h er a n g eo f0 1 5 0n g m l t h ei n t r a - a n d i n t e r - d a yr s d sw e r eb o t hb e l o w5 4 4 t h el i m i to fq u a n t i f i c a t i o n ( t o o ) w a s2 5 i 咀g k g a n dt h em e a nr e c o v e r i e sr a n g e df r o m8 1 2 t o9 3 3 o u to fat o t a l2 8t c m a n dr e l a t e dp r o d u c t s ，c i t r i n i nw a sf o u n di n6s a m p l e s ，r a n g i n gf r o m8 5 5 i t g k g t o 3 5 7 5i t g k g t h em e t h o dw a sp r o v e dt ob es u i t a b l ei nt h ed e t e r m i n a t i o no fc i t r i n i ni n t h ec o m p l i c a t e dt c mm a t r i c e s k e yw o r d s ：t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e ，r e dy e a s tr i c e ，c i t r i n i n ，h p l c ，m s i v 江苏大学硕士学位论文 摘要。 a b s t r a c t 。 目录 目录 i i i 1 r 第一章绪论。1 1 1 桔青霉素简介1 1 1 1 桔青霉素的理化性质1 1 1 2 桔青霉素的污染状况2 1 1 3 桔青霉素的毒性作用3 1 1 4 桔青霉素的降解。4 1 2 红曲与桔青霉素4 1 2 1 红曲的简介4 1 2 2 红曲中桔青霉素的合成途径。5 1 3 桔青霉素分析方法概述6 1 3 1 样品前处理6 1 3 2 定量检测8 1 4 桔青霉素立法与控制1 2 1 5 本课题的立题背景和意义1 2 1 6 主要研究内容1 3 第二章红曲中桔青霉素高效液相色谱分析方法的建立。1 4 2 1 实验部分1 4 2 1 1 仪器与试剂1 4 2 1 2 溶液配制1 5 2 1 3 实验方法1 5 2 2 结果与讨论1 5 2 2 1 检测器的选择1 6 2 2 2 前处理方法的考察1 8 2 2 3 方法学考察2 1 2 2 4 样品测定2 5 2 2 5l c m s m s 确证结果2 6 v 中药中桔青霉素检测方法的研究 2 3 本章小结2 8 第三章中药中桔青霉素高效液相色谱分析方法的建立3 0 3 1 实验部分3 0 3 1 1 仪器与试剂3 0 3 1 2 溶液配制一3 0 3 1 3 实验方法。3 1 3 2 结果与讨论3 1 3 2 1 净化方法的选择3 1 3 2 2 方法学考察3 2 3 2 3 样品测定。3 7 3 3 本章小结3 8 第四章高效液相色谱一串联质谱检测桔青霉素方法的建立4 0 4 1 实验部分4 0 4 1 1 仪器与试剂。4 0 4 1 2 溶液配制4 0 4 1 3 实验方法4 1 4 2 结果与讨论4 2 4 2 1 电离模式和内标的选择4 3 4 2 2 方法的专属性4 3 4 2 3 方法学考察。4 4 4 2 4 样品测定。4 8 4 3 本章小结5 0 第五章总结与展望 5 1 主要研究结论。5 1 5 2 工作展望5 2 参考文献 致谢 攻读硕士学位期间发表论文 v i 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 桔青霉素( c i t r i n i n ) 是青霉属( p e n i c i l l i u m ) 、曲霉属( a s p e r g i l l u s ) 、红曲霉属 ( m o n a s c u s ) r 中的丝状霉菌代谢产生的一种真菌毒素。桔青霉素最初是1 9 3 1 年从青 霉属中的桔青霉( p c i t r i n u m ) d 尸分离得到，其它已知的能产生桔青霉素的菌种如 变灰青霉( p c a n e s c e n s ) 、扩展青霉( pe x p a n s u m ) 、闪白曲霉似c a n d i d u s ) 、黄柄 曲霉似伽y 勿砷、紫红曲霉( mp u r p u r e u s ) 、红曲霉( mr u b b e r ) l 等。桔青霉素 在自然界中分布极其广泛，对人畜健康危害十分严重，具有致癌、致畸、致突变 的潜在危害，还与某些地方性疾病的发生有密切联系。近年来，桔青霉素对人类 健康的严重影响越来越引起各国学者的注意，1 9 9 1 年【4 】在法国里昂召开的真菌毒 素和地方肾病与泌尿道肿瘤研讨会上，讨论了桔青霉素在巴尔干地方肾病发生中 的作用，引起了国际癌症研究学会的高度重视。 1 1 桔青霉素简介 1 1 1 桔青霉素的理化性质 桔青霉素分子结构如图1 1 ，分子式为c 1 3 h 1 4 0 5 ，分子质量为2 5 0 ，化学名称 为( 3 r ，4 s ) 4 ，6 二氢8 一羟基- 3 ，4 ，5 三甲基6 - 氧- 3 氢一2 - 苯吡一7 一羧酸。其纯品呈柠檬 黄色针状棱形结晶，熔点为1 7 8 1 7 9 。c 。桔青霉素极难溶于水，可溶于氯仿、丙 酮、乙酸乙酯等有机溶剂，桔青霉素可形成螯合物，但在酸性及碱性溶液中皆可 热解【3 - 7 1 。 o h h o o c o c h 3 c h 3c h 3 图1 1 桔青霉素的化学结构 f i g 1 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fc i t r i n i n 中药中桔青霉素检测方法的研究 1 1 2 桔青霉素的污染状况 由于桔青霉素最早是1 9 3 1 年从青霉属中的桔青霉( p c i t r i n u m ) d p 分离得到， 因此桔青霉是自然界中比较重要的桔青霉素产生真菌，尤其是在温暖的气候条件 下繁殖迅速，在温度为2 6 。c 3 0 。c 时，桔青霉代谢产生的桔青霉素的量最大，产 毒最高，而温度超过3 7 。c 时，代谢产生的桔青霉素的量则会大大降低。另外桔青 霉素在水活度大于等于0 8 时才会产生，而且产量会随着水活度的增高而加大。 不同菌株代谢产生桔青霉素所需要的最适温度范围和水活度临界值是不同的 s q o 。据文献报道【1 1 】称，在硬粒小麦的储存实验中，在含水量为1 5 1 9 的湿度 环境下，桔青霉素在第2 4 周后开始产生，在第4 8 周后达到了最高浓度8 0m g k g ， 在之后桔青霉素含量下降，一直到第6 0 周时下降n 2 0m g k g l 拘浓度。 桔青霉素往往和大米、玉米、麦麸等的农产品或饲料的霉变有关。调查研究 显示，桔青霉素是一类全球性的谷物污染物，如文献中丹麦、加拿大、印度、瑞 士、突尼斯等国家都出现过谷物以及谷类产品被桔青霉素污染的报道。在多种谷 物( 小麦、玉米、燕麦、大麦) 和饲料中均有检出，面包、奶酪、果汁等食品都 有可能被桔青霉素污染。 k o n o n e n k o 等【1 2 】采用间接酶联免疫测定法对包括谷类饲料、含葵花籽油和大 豆油的食品、配合饲料在内的1 7 0 0 多个样品中的桔青霉素进行了检测。8 2 9 种配 合饲料中有8 8 为阳性样品，桔青霉素污染水平为1 2 1 8 2n g g 。4 5 的小麦样品 和3 6 的大麦样品毒素污染水平为5 0 9 9 8n g g 。含葵花籽油的食品中有2 8 9 的 阳性样品，污染水平为1 4 3 9 7n g g 。1 4 8 种大豆油样品中有三种阳性样品，污染 水平为1 4 3 0n g g 。 v r a b c h c v a 1 3 】等对来自保加利亚的总共9 4 个样品进行了桔青霉素和赭曲霉 素的污染调查。样品主要为食品( 小麦、玉米) 和饲料( 大麦、燕麦、麸皮) ， 其中7 4 个样品来具有b a l c a n 地方肾病史的村庄，另外2 0 个样品则来自无病史 的村庄。桔青霉素的调查结果为：来自有病史村庄的样品有1 1 个为阳性样品， 而无病史的村庄仅有1 个阳性样品；污染率分别为1 4 9 和5 。桔青霉素最高 污染水平为4 2 0n g g ，且最高污染水平的样品来自具有b a l c a n 地方肾病史的村 j 生。 2 江苏大学硕士学位论文 1 1 3 桔青霉素的毒性作用 最初桔青霉素是作为抗生素从青霉属中分离得到，并加以研究的，实验结果 发现，它能有效地抑制芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、蜡状芽抱杆菌、结核分枝杆菌 和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌抑制较弱，但在后来的研究 中发现，桔青霉素是一种具有毒性的次级代谢产物【1 4 】。 桔青霉素主要是一种肾毒性毒素，与日本的黄变米有关。它能引起多种动物 肾脏病变，人和动物如摄入被桔青霉素污染的粮食及其制品后，可引起肾脏肿大、 尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死、血氮升高和尿氮升高等症状。它还 是一种肝毒性毒素，会导致动物肝细胞坏死和胆囊增生等肝脏病变。甚至还可以 导致畸形、肿瘤，诱发突变。桔青霉素对动物的生殖系统也有一定的危害。近年 研究表明，桔青霉素可能与赭曲霉毒素一样，都被称为巴尔干地方肾病潜在致病 因子，对人畜健康构成较大的威胁。目前文献中报道【1 5 l 的桔青霉素的致病机理为： 在线粒体内聚集且干扰电子传递系统，导致d n a 合成受到抑制，并进一步使r n a 和蛋白质合成受到抑制，肝糖原下降，胆固醇和甘油三酸酯合成受阻。另外，桔 青霉素还能与其它真菌毒素，如赭曲霉素( o c h r a t o x i n ) 、展青霉素c o a t u l i n ) 等起协 同作用，增加对机体的损害【1 6 1 刀。 1 1 3 1 肾毒性 m e h d i 等【1 8 】人将桔青霉素用d m s o 7 0 7 , 醇( 3 ：1 ，v v ) 混合溶剂溶解后， 对7 天大的雄性火鸡幼雏和雄性小鸭子进行实验，火鸡口服桔青霉素的l d 5 0 为 5 6m g k g b w ，小鸭子口服桔青霉素的l d s o 为5 7m g k g b w ，对这两种物种来说， 桔青霉素都具有肾毒性，但是对于火鸡来说，肾脏病变更为严重，表现在肾小管 上皮细胞退化和坏死，肝脏也同时发生了肝细胞坏死和胆囊增生等病理学变化， 胸腺和法氏囊的淋巴细胞坏死凋亡等症状。 1 1 3 2 致癌性 在对f 3 4 4 雄性大鼠进行长期( 8 0 周) 的测试中，饲料中添加桔青霉素1 g k g b w ，结果4 8 只大鼠中有3 5 只组织病理学影像证实发现肾脏明细胞腺瘤【1 9 1 。 1 1 3 3 胚胎毒性和致畸性 对妊娠期3 1 5 天的大鼠单剂量给药桔青霉素3 5m g k g b w ，没有发现胚胎骨 骼畸形，但是出现了肾肿大、脑内积水、腭裂的症状。5 0 的妊娠大鼠死亡【铡。 3 中药中桔青霉素检测方法的研究 据c i e g l e r 等人的研究结果显示，在给发育4 天的鸡胚胎注射桔青霉素后，胚胎 中的脚发生了变形。 1 1 3 4 对生殖系统的危害 成年雄性小鼠每天腹腔注射桔青霉素0 - 6 2 5m g k g b w ，连续7 天，与未给药 的性成熟的雌性小鼠交配，评估摄入桔青霉素小鼠的生殖器官相对重，精子质量， 血清中睾丸素的浓度和生育能力。实验结果显示，桔青霉素能明显增加睾丸、附 睾、精囊的相对重，畸形精子的数目增多，存活精子的数目减少，与摄入桔青霉 素雄性小鼠的交配的雌性小鼠妊娠率也明显降低，组织病理学结果显示，睾丸生 精小管间距变大，精子数和睾丸素浓度都有明显的下斛2 1 1 。 1 1 3 5 对消化系统的影响 许建平等【2 2 】为为探明桔青霉素对动物机体小肠运动的影响，以健康家兔为试 材，研究了桔青霉素对其小肠平滑肌活动的影响效果。结果表明，0 1m g m l 桔 青霉素能使小肠运动的张力增加，收缩幅度增大，证明桔青霉素对小肠平滑肌具 有兴奋作用，有可能导致动物机体胃肠功能紊乱，发生腹泻。 1 1 4 桔青霉素的降解 桔青霉素与其他真菌毒素相比，对于热源更为敏感。它的抗菌活性在1 0 0 0 c 和p h 值为2 9 5 的环境下1 5m i n 后开始下降，在温度为6 0 7 0 。c 时，桔青霉素开始 降解。紫外线照射在某种程度上也能降低桔青霉素的活性。 对于桔青霉素的降解问题，人们研究的较早，主要有物理法和化学法两种。 k i t a b a t a k e 等人【2 3 】报道中指出，桔青霉素在潮湿环境下加热多j1 4 0 。c 可使毒性去 除，但之后发现，虽然桔青霉素在加热的过程中已被破坏，但却转化成为毒性更 强的桔青霉素h 1 ，因此该法不可行。m a d s e m 等人【纠报道中指出，加人0 5 n a o h 溶液，加热至1 0 0 1 1 0 。c 时，可使桔青霉素的毒性完全消失。除此之外，桔青霉 素与0 0 5 的过氧化氢在室温下接触3 0m i n 可彻底去除桔青霉素的毒性【2 5 1 。 1 2 红曲与桔青霉素 1 2 1 红曲的简介 红曲，又称为丹曲、赤曲、红米。在亚洲已有一千多年的历史，是中国及周 4 江苏大学硕士学位论文 边国家特有的大米发酵产品。红曲是以籼稻、粳稻等为原料，用红曲霉属真菌发 酵制备而成的棕红色或紫红色米粒。红曲在饮膳正要中记载：“健脾、益气、 温中”，明代李时珍在本草纲目中说：“此乃人窥造化之巧者也”。红曲用途 极为广泛，不仅可以用作天然食用色素，用于食品着色和酿酒，而且作为中国的 传统中药，具有活血化瘀、健脾消食等功效，可用于治疗食积饱胀、产后恶露不 尽、痕滞腹痛和跌打损伤等症。近年来研究发现，红曲中的化学成分莫纳可林 ( m o n a c o l i nk 、l 、j ) 具有抑制胆固醇合成、降低血脂的功效【孙2 s 。因此，以红曲 为原料研制出多种降压降脂的中药制剂，如红曲片、复方红曲胶囊、脂必妥片、 血脂康胶囊【2 9 3 0 】等。 1 2 2 红曲中桔青霉素的合成途径 但自从1 9 9 5 年b l a n c 3 1 】证实了红曲霉菌能代谢产生真菌毒素桔青霉素后，使 得国内红曲霉发酵产品的安全性受到了极大挑战，同时给消费者的食品安全也带 来了很大的危害。桔青霉素问题成为限制我国红曲及其相关产品出口的瓶颈。李 凤琴等【3 2 1 对购自市场和厂家送检的1 1 4 个红曲产品中桔青霉素的污染情况进行了 研究。调查结果显示，1 1 4 份样品中桔青霉素阳性样品6 8 份，阳性率5 9 6 5 ，污 染水平范围0 1 8 1 7 3 9 2 3m g k g ，平均污染水平2 1 1 6 1m g k g ，国产红曲制品不同 程度被桔青霉素污染，所调查样品中有1 5 份色价桔青霉素比值超过日本标准。 红曲中的桔青霉素是红曲霉发酵产生的次级代谢产物，桔青霉素与红曲色素 的合成开始在同一途径上，由1 个乙酰辅酶a 和3 个丙二酰辅酶a 合成丁酮和辅酶， 复合物经甲基化，在丙二酰辅酶a 的参与下合成戊酮，然后分开为两条途径，一 条最终合成红曲色素，另一条途径最终合成桔青霉素。一般来说，桔青霉素通常 伴随红曲色素的产生而生成。如果从代谢途径考虑，切断戊酮到桔青霉素这一段 的代谢途径，则可以有效地减少桔青霉素的含量，又能保证较高的红曲色素的产 量【3 3 1 。h a j j a j 等1 3 4 】人研究发现，添加脂肪酸和甲基酮，可抑制桔青霉素的生成， 同时并不影响红曲色素的合成，对不同碳链长度的脂肪酸和不同结构的甲基酮对 色素和桔青霉素生成的影响进行了实验，结果显示，尤其是2 三十碳酮的加入， 能强烈抑制桔青霉素的生成。可能是脂肪酸和甲基酮的加入抑制了桔青霉素形成 的分路反应，也可能是由于脂肪酸的加入增加了过氧化物的活性从而使桔青霉素 毒性消失。因此，合适菌株的筛选以及发酵工艺的优化还需要更加深入的研究， 5 中药中桔青霉素检测方法的研究 既能抑制桔青霉素的生成，又能最大限度的提高红曲色素和降脂成分的产率 【3 5 - 4 2 o 1 3 桔青霉素分析方法概述 当产生桔青霉素的真菌寄生在植物中，很有可能会作为污染物在食物和饲料 中发现桔青霉素，并且多数是痕量级的。因此必须对桔青霉素建立可靠、灵敏、 简单且可定量的分析方法。应用最广泛的桔青霉素测定方法主要是高效液相色谱 法，测定桔青霉素的其它技术还有薄层色谱法、液质联用法( l c m s ) 、气质联 用法( g c m s ) 、酶联免疫测定法( e l i s a ) 和毛细管电泳法( 肿c e ) 等。分 析桔青霉素的过程主要包括样品前处理和定量检测。 1 3 1 样品前处理 样品前处理是桔青霉素测定过程中很关键的一个环节，前处理方法和提取溶 剂的选择都关系到检测结果的准确性和可行性。文献中提到的样品前处理的方法 主要有液液萃取技术( l l e ) ，固相萃取技术( s p e ) ，免疫亲和柱净化技术( i a c ) 艚 号手。 液液萃取技术主要是利用了毒素在水相和有机相中溶解度的不同，利用一