丙氨酸氨基转移酶催化活性浓度测定无磷酸吡哆醛参考方法.pdf

i c s1 10 2 0 c5 0 v s 中华人民共和国卫生行业标准 w s t3 5 2 2 0 11 丙氨酸氨基转移酶催化活性浓度测定 ( 无磷酸吡哆醛) 参考方法 r e f e r e n c ep r o c e d u r ef o rt h em e a s u r e m e n to fc a t a l y t i ca c t i v i t yc o n c e n t r a t i o no f a l a n i n ea m i n o t r a n s f e r a s e ( n op y r i d o x a l 。5 。p h o s p h o r i ca c i d ) 2 0 11 - 0 9 - 3 0 发布2 0 1 2 0 4 0 1 实施 中华人民共和国卫生部发布 w s t3 5 2 2 0 目次 前言- 一i 1 范围 - - 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和缩略语 1 31 术语和定义 1 32 缩略语 2 4 参考方法描述 一3 41 测定原理和方法 3 4 2 检查列表 3 4 3 试剂 4 44 仪器 ， 7 4 5 采样和样本 7 46 测定系统和分析部分的准备 一8 47 酶催化活陛浓度测定 一 - 1 1 48 测定结果处理 一1 3 49 分析可靠眭 1 4 41 0 通过实验室闻比对进行确认 1 4 4 1 l 参考区间 1 4 4 1 2 报告 15 4 1 3 质量保证 1 5 附录a ( 规范性附录) 测定储存酶溶液中l d 催化活性浓度 1 6 附录b ( 资料性附录) 试剂原料详细信息 1 9 附录c ( 规范性附录) 不同温度下溶液1 、溶液2 的p h 值 2 3 附录d ( 资料性附录) a l ti f c c3 7 参考方法与3 0 参考方法的比较2 5 参考文献 2 7 前言 w s t3 5 2 2 0 本标准按照g b t1 12 0 0 9 给出的规则起草。 本标准修改采用由国际检验医学溯源联合委员会( j c t l m ) 批准的i f c c3 7 酶催化活性浓度测 定原级参考方法第4 部分：丙氨酸氨基转移酶催化浓度测定参考方法，将原参考方法试剂中磷酸吡 哆醛去掉，重新建立依据本标准的参考区间，并参考i s o1 5 1 9 3 ：2 0 0 9 体外诊断器具生物源样品中量 的测定参考测定程序的表述适当增加内容。 本标准的附录a ，附录c 为规范眭附录，附录b 、附录d 为资料性附录。 本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。 本标准起草单位：北京航天总医院。 本标准主要起草人：陈宝荣、邵燕、孙慧颖、胡滨、陈琦。 范围 丙氨酸氨基转移酶催化活性浓度测定 ( 无磷酸吡哆醛) 参考方法 w s t3 5 2 2 0 本标准规定了在l 临床医学应用中，测定丙氨酸氨基转移酶( a l t ) 催化活性浓度( 无磷酸吡哆醛) 的 参考方法。 本标准主要适用于参考宴验室，作为丙氨酸氨基转移酶催化活性浓度( 无磷酸毗哆醛) 测定的溯源，也 可作为与酶活性浓度检验有关的仪器和试剂生产企业的溯源，可供有关认可单位及质量管理部门应用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 i s o1 5 19 3 ：2 0 0 9 体外诊断器具生物源样本中量的测定参考测定程序的表述 3 术语和缩略语 31 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 31 1 原始样本p r i m a r ys a m p l e 最初从一个系统中取出的一个或几个部分的集合物，旨在提供该系统的信息或作为对该系统做出 决定的基础。 洼：在某些情况下，所提供的信息可以适用于一个较大的系统或一组系统- 此时取样系统是这些系统的组盛部分。 3 2 实验室样本l a b o r a t o r ys a m p l e 准备送到实验室或实验室接收的用于测定的原始样本或原始样本的分样本。 3 1 3 分析样本a n a l y t i c a ls a m p l e 自实验室样本制备的、可从中取出分析部分的样本。 洼：在取出分析部分之前，分析样本可经过各种处理。 3 1 4 分析部分a n a l y t i c a lp o r t i o n 从分析样本中取出的用于实际测定和观察的物质部分。 注：如果不需预处理，分析部分直接从原始样本或实验室样本中取出。某些情况下，需将分析部分溶解成分析溶液 再上机涮定。 315 分析溶液a n a l y t i c a ls o l u t i o n 将分析部分溶解在气体，液体或固体中而制备的溶液，溶解过程中可以有反应发生或无反应发生。 1 31 6 ( 某一物质系统的) 基质m a t r i x ( o fam a t e r i a ls y s t e m ) 一个物质系统中除被分析物之外的所有成分。 317 参考方法r e f e r e n c ep m c e d 宙e 是在校准或表征标准物质时为提供测定结果所采用的测定方法，它适用于评定由同类量的其他测 定方法获得的被测定量值的测定正确度。 318 测定系统的灵敏度s e n s i t i v i t yo fam e a s u r i n gs y s t e m 简称：灵敏度s e n s i t i v i t y 测定系统的示值变化除以相应的被测定值变化所得的商。 注1 测定系统的灵敏度可能与被测定的量值有美。 洼2 所考虑的被测定值的变化必须大于测定系统的分辨力。 31 9 分析特异性a n a l y t i c a ls p e c i f i c i t y 测定方法只测定可测定的量的能力。 311 0 分析干扰a n a l y t i c a li n t e r f e r e n c e 由一个影响量引起的系统测定误差，该影响量自身在测定系统中不产生信号，但它会引起示值的增 高或降低； 311 1 影响量i n f l u e n c eq u a n t i t y 被测定以外的可影响测定结果的量。 311 2 被测量m e a s u r a n d 拟测定的量。 注1 ：对被测定的说明要求了解量的种类，以丑古有该量的现象、物体或物质状态的描述，包括有关戒分及所涉及的 化学实体。 注2 ：在v i m 第二版和i e c6 0 0 5 0 - 3 0 0 ：2 0 0 l 中，被测定定义为受到测定的量。 洼3 ：测定包括测定系统和宴施榭定的条件，它可能会改变研究中的现象、物体或物质，使被测定的量可能石同于定 义的被涮定。在这种情况下，适当的修正是必要的。 3i1 3 检出限d e t e c t i o n l i m i t ，l i m i to fd e t e c t i o n 由给定测定方法获得的测得值，其声称的物质成分不存在的误判概率为口，声称物质成分存在的误 判概率为a 。 注1 ：国际理论和应用化学联合会( i u p a c ) 推荐a 和口的默认值为00 5 。 洼2 ：有时使用缩写词l o d 。 洼3 ：不要用术语“灵敏度”表示“检出限”。 3 1 1 4 校准品c a l i b r a t o r 用于校准的测定标准。 3 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件 2 a l t ：丙氨酸氨基转移酶( a l a n l n ea m i n o t r a n s f e r a s e ) l d ：乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ) n a d ：氧化型 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n i e o t i n a m i d e - a d e n i n e _ d i n u c l e o t i d e ，o x i d i z e df o r m ) n a d h ：还原型p - 烟酰胺腺瞟呤二核苷酸( p n i c o t i n a m i d e a d e n i n e - d i n u c l e o t i d e ，r e d u c e df o r m ) p - 5 一p ：5 磷酸吡哆醛( p y r i d o x a l 5 一p h o s p h o r i ca c i d ) i f c c ：国际临床化学与检验医学联合会( i n t e r a a t i o n a lf e d e r a t i o no f c l i n i c a lc h e m i s t r ya n d l a b o r a t o r ym e d i c i n e ) s o p ：标准操作方法( s t a n d a r do p e r a t i o np r o c e d u r e ) 4 参考方法描述 4 1 测定原理和方法 本法采用偶联反应，l - 丙氨酸和a 酮戊二酸在a l t 催化下，生成丙酮酸和l - 谷氨酸，丙酮酸在l d 催化下生成乳酸，同时n a d h 被氧化成n a d + ，反应式如下： l - n 氨酸+ 2 酮戊二酸兰坚丙酮酸+ l _ 谷氨酸 丙酮酸+ n a d h + h + 旦乳酸+ n a d 一 在3 3 9n m 下，监测n a d h 的氧化速率，摩尔消光系数的下降速率与a l t 催化活性浓度呈正比。 42 检查列表 421 试剂列表 将所用试剂按表1 列出。 表1 试剂列表 分类系统名称通用名称、缩略语 三羟甲基氨基甲兢 l ( + ) 丙氨酸 丙氨酸 2 酮戊二酸，二钠盐，二水合物2 酮戊= 酸 烟酰胺腺嘌呤二棱苷酸，还原型，二钠盐还原辅酶i ，n a d h 无乳酸脱氢酶，l d 试剂叠氮钠无 盐酸 元 氢氧化钠元 氯化钠无 牛血清白蛋白，f r a c t i o nv 牛白蛋白 丙酮酸一钠盐 无 质量与双蒸水类似的高纯度水( 电导率 2 “s ， 溶剂无 p h6 7 硅酸盐 ol 协g l1 ) 参考物质j c t l m 和( 或) 国家批准的参考物质 无 质控物质常规系统校准品无 指示剂无元 w s t3 5 2 2 0 4 22 分光光度计和辅助仪器列表 参考实验室应在表2 登记主要测定仪器( 分光光度计) 和主要辅助仪器( 点式温度计、天平、p h 计 恒温水裕箱、稀释配液仪、移液器等) 。 表2 分光光度计和辅助仪器 仪器名称生产厂家型号 分光光度计 点式温度计 天平 p h 计 恒温水浴箱 稀释配液仪 移液器 43 试剂 4 31 试剂原料信息 釜表3 详细填写试剂原料详细信息。 表3 试剂原料详细信息 试剂系统名通用名 信息指标内容 c a s ，c a r n 注册号 生产厂家 货号批号 分子式 相对分子质量 纯度 特定合格要求( 如有) 危险度 贮存要求 失效期 a l t 测定所用每个试剂原料详细信息见附录b 。如怀疑一种化学药品含有不纯的物质影响了分 析物的催化活性，应进行进一步的研究，例如，比较不同厂家和不同批号的产品。宜使用在对比试验中 已经鉴定或认可的试剂。以下三种试剂需要注意安全： 盐酸健康危害：接触其蒸气或烟雾，可引起急性中毒，出现眼结膜炎，鼻及1 3 腔黏膜有烧灼感，鼻衄、 齿龈出血，气管炎等。误服可引起消化道灼伤、溃疡形成，有可能引起胃穿孔、腹膜炎等。眼和皮肤接触 可致灼伤。慢性影响：长期接触，引起慢性鼻炎、慢性支气管炎、牙齿酸蚀症及皮肤损害。操作人员必须 经过专门培训，严格遵守操作规程。操作人员宜佩戴自吸过滤式防毒面具( 全面罩) ，穿橡胶耐酸碱服， 戴橡胶耐酸碱手套。远离易燃、可燃物。 4 w s t3 5 2 2 0 氢氧化钠有强烈刺激和腐蚀性。粉尘或烟雾会刺激眼和呼吸道，腐蚀鼻中隔；皮肤和眼与n a o h 直接接触会引起灼伤；误服可造成消化道灼伤，黏膜糜烂、出血和休克。本品不会燃烧，遇水和水蒸气大 量放热，形成腐蚀性溶液。与酸发生中和反应并放热。具有强腐蚀性。燃烧( 分解) 产物：可能产生有害 的毒性烟雾。呼吸系统防护：必要时佩带防毒口罩。眼睛防护：戴化学安全防护眼镜。防护服；穿工作 服( 防腐材料制作) 。手防护：戴橡皮手套。 叠氮钠：本品和氰化物相似，对细胞色素氧化酶和其他酶有抑制作用，并能使体内氧合血红蛋白形 成受阻，有显著的降压作用。对眼和皮肤有刺激性。如吸入、口服或经皮肤吸收，可引起中毒死亡。高 血压病人口服本品有显著降压作用。本品在有机合成中可有叠氮酸气体逸出，吸人中毒后出现眩晕、虚 弱无力、视觉模糊、呼吸困难、昏厥感、血压降低、心动过缓等。呼吸系统防护：可能接触其粉尘时，应佩 戴头罩型电动选风过滤式防尘呼吸器。紧急事态抢救或撤离时，宜佩戴自给式呼吸器。眼睛防护：呼吸 系统防护中已作防护。身体防护：穿连衣式胶布防毒衣。手防护：戴橡胶手套。其他：工作现场禁止吸 烟、进食和饮水。工作毕，淋浴更衣。单独存放被毒物污染的衣服，洗后备用。保持蘸好的卫生习惯。 皮肤接触；脱去被污染的衣着，用肥皂水和清水彻底冲洗皮肤。跟睛接触：提起眼睑，用流动清水或生理 盐水冲洗，就医。吸人：迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，给输氧。如呼吸 停止，立即进行人工呼吸。就医。若误食：饮足量温水，催吐，就医。 432 试剂溶液 43 2 1 一般要求 制备溶液时各成分给出的质量是指l 。o “含量。如果化学物质的含量低于1 0 0 例如y ( ) ，则 应用因子f 一1 0 0 y ，计算出与给出质量相当的某化学物质的质量。 溶液的制备应使用质量与双蒸水类似的高纯度水( 电导率 2p s c m ，p h 6 7 ，硅酸盐 - 0 1 m g l _ 1 ) 。 每次称重的扩展( k - - 2 ) 不确定度( 包括物质纯度的不确定度) ( 正态分布) ，应1i 。 43 22 溶液1 称量l _ 4 7gt r i s 、56 1g 丙氢酸( 游离酸) 及00 5 2g 叠氮钠，将上述物质按以下步骤处理： 溶在约8 0m l 水中； 用1m o l l _ 盐酸调节p h 值( 3 7 c ) 至7 1 5 ； 转移至1 0 0m l 容量瓶中； 将容量瓶和水平衡至2 0 ； 加水( 2 0 ) 至容量瓶的刻度线。 最终配制的溶液中t r l s 浓度为1 2 12m m o i l 、丙氨酸( 游离酸) 浓度为6 3 0 0m m o l l 、叠 氮钠浓度为8 0 0m m o l - l 。该溶液2 8 稳定性为3 个月。 432 3 溶液2 称量14 7g t r i s 、00 5 2g 叠氯钠，将上述物质按以下步骤处理： 溶在约8 0m l 水中； 用1m o l - l _ 1 盐酸调节p h 值( 3 7 ) 至71 5 ； 转移至1 0 0m l 容量瓶中； 将窖量瓶和水平衡至2 0 ； 加水( 2 0 ) 至容量瓶的刻度线， 最终配制的溶液中t r i s 浓度为1 2 12 m m o l l 、叠氨钠浓度为80 0 m m o l l 。该溶液2 5 w s t3 5 2 2 0 8 稳定性为3 个月。 4 32 4 溶液3 称量1 61m gn a d h 二钠盐，将上述物质按以下步骤处理： 溶于20 0m l 溶液2 中； 避光保存( 如棕色瓶) 。 最终配制的溶液中n a d h 二钠盐浓度为1 13 4m m o l l 。该溶液2 8 稳定性为1 周 4 3 25 酶试剂的稀释液 称量1 2 0g 牛血清白蛋白、09 0gn a c l ，将上述物质按以下步骤处理： 溶于约8 0m l 水中； 转移至1 0 0m l 容量瓶； 将容量瓶和水平衡至2 0 ； 加水( 2 0 ) 至容量瓶刻度线。 最终配制的溶液中n a c l 浓度为1 5 4m m o l l 。该溶液2 8 稳定性至少1 个月 4 3 25 溶液4 用43 2s 中的酶试剂稀释液稀释l d 储存液，使1 2 d 催化活性浓度在3 7 时为3 ，5 7m k a t l 叫 ( 2 1 42k u l 叫) ，按公式( 1 ) 计算稀释l d 储存液所需酶试剂稀释液体积： k 一生型等手二坠型 “1 ) 菇中： v 蛳。稀释l d 储存液所需酶试剂稀释液体积，单位为毫升( m l ) ； v l d 储存液体积，单位为毫升( m l ) ； l d 。诎l d 储存液中l d 催化活性浓度，单位为毫凯塔尔每升( m k a t l _ 1 ) 或千单位每 升( k u - l 叫) 。 示倒：见附最a 。 最终配制的溶液中l d 催化活性浓度在3 7 时为35 7m k a t - l 叫( 2 1 42k u l _ 1 ) 。该溶液 2 8 稳定性至少2d 。 43 27 反应溶液 分别移取1 0 0m l 溶液1 、02 0 0r a l 溶液3 、0 2 0 0 m l 水、0 1 0 0m l 溶液4 ，将上述溶液充分混 匀、避光保存。该溶液2 8 稳定性为1 d 。 43 2 8 起始试剂溶液 称量04 0 7g2 _ 酮戊二酸二钠二水化舍物，将上述物质按以下步骤处理： 溶于约6m l 水中； 转移至1 0m l 容量瓶； 将容量瓶和水平衡至2 0 ； 加水( 2 0 ) 至刻度线。 最终配制的溶液中2 一酮戊二酸二钠二水化合物浓度为1 8 0 0m m o l l 。该溶液2 8 稳定 性为1 周。 6 433 温度对缓冲溶液p i l 的影响 当温度偏离3 7 时，调节p h 值的方法：将温度计与p h 电极同时浸入混合液中。然后将溶液边 搅拌边滴定至表中列举在当前测定温度下的p h 值。在校准、控制和调节p h 的过程中，搅拌速度要一 致。p h 电极应位于被搅拌溶液的中心。 应考虑到在调节p h 的滴定过程中，温度是可能改变的因素。为此，接近靶值时应重新控锚温度， 如果需要，根据附录c 调整p h 靶值。同样的方法也适用于p h 计的温度补偿调节。 配制溶液1 、溶液2 时，需根据不同温度调整p h 值。参阅附录c 来调节溶液的p h 值。 44 仪器 分光光度计及辅助仪器主要性能的要求，见表4 。 表4 分光光度计、辅助仪器主要性能的要求 仪器名称性能指标i f c c 参考方磕要求 波长准确度r i m 分光光度计、配件l 翌皇! ! 竺 一 2 光径m m 1 0o o 00 l 强= 2 ) p h 计ph值 点式温度计温度 耵0 0 1 ( = 2 ) 45 采样和样本 451 通则 参考实验室主要接受外柱标本，不自行采血，一般不需考虑分析前因素对样本特性的影响 452 对收检样本的要求 宜以表格形式记录样本的详细信息，见表5 。对不符台样本收检要求的样本应及时与委托方联系 表5 a l t 收检样本要求 蔓隶指标内容 可接受样本种类口血清口血浆口其他 可接受样本类型 口冻干粉口液体口冰冻口其他 基质类型说明口人血清口牛血清口水口其他 样本最低数量支 每支样本最低体积每支 m l 允许舔加物 运轴条件口干冰口常温口冰袋口其他 贮存条件 口常温口4 口一2 0 口一7 0 口其他 稳定性 危险性 注意事项 w $ 1 ：3 5 2 2 0 4 6 测定系统和分析部分的准备 4 6 1 测定系统的准备 4 61 1 分光光度计准备 测定工作前，按已制定的s o p 文件对分光光度计进行检查，填写表6 衰6 分光光度计准备 准备事项具体内容 口电源口接地口电脑口打印机口是否2 4h 开机 开机前检查 口温度口湿度口机身清洁口比色仓清洁口比色窗清洁 恒温装置：口与分光光度计连接完整口提前开机 测温装置：口电量口测温探头勿挤压、碰撞坚硬物体 组台 搅拌装置：口清洁口转速 比色杯：口完整口清洁度 光源灯：口提前预热 开机注意事项 比色杯：口光径e 出色杯间匹配 按实是否在国家计量机构检定合格有效期内 每日开机性能检查：量波长准确麦 菠长重复性口基线平直度 暑描 仪器性能检壹口带宽测试 噪音测试 大型宴验前性能检查：二氧化钛玻璃检查渡长准确度 国家标准藩禳检查摩尔消光系数准确度 分光光度计口无明显振动e 受时待机 口无线电干扰口u p s 预防眭维护 辅助仪器：口更换进、出水管口定期清洁 口使用后清洁电温计探头、搅拌装置 各实验室可根据具体情况制定本实验室分光光度计准备流程图。 4 61 2 点式温度计准备 测定工作前，按巳制定的s o p 文件对点式温度计进行检查，填写表7 表7 点式温度计准备 准备事项具体内容 开机前检查口电潭口机身清洁口点式温度计温度探头是否正常 组合 口主机与点式温度计温度探头连接完整 电量：口查看剩余电量 开机注意事项 拉准提示：口查看校准有效期是否到期 桉实是否在国家计量机构检定合格效期内 仪器性能检查 大型实验前性能检查：口用计量合格的标准温度计检查温度的准确性 主机：口机身清洁 预防性维护温度探头口使用后厦时清洁 口保证直形、不弯曲 各实验室可根据具体情况制定本实验室点式温度计准备流程图 4613 恒温水浴箱准备 测定工作前，按已制定的s o p 文件对恒温水浴箱进行检查，填写表8 表8 恒温水浴箱测定系统的准备 w s t3 5 2 2 0 准备事珥具体内容 开机前检查口电源口温度口湿度口机身清洁 组舍口与分光光度计连接 开机注意事项口水量口进口水管口出口水管 仪器性能检查口温度校正口温度稳定性 口定期更换进口水管口定期更换出口水管 预防性维护 口清洗稳网口水箱内部稍毒 各实验室可根据具体情况制定本实验室恒温水浴箱准备流程图 4 614 稀释配液仪准备 实验室若有稀释配液仪，在测定工作前，按已制定的s o p 文件对稀释配液仪进行检查，填写表9 表9 稀释配液位测定系统的准备 准备事项具体内容 开机前检查口电源口温度口湿度口机身清洁 开机注意事项口注射器口移渡口口管路冲洗 仪器性能检查口加样量正确性口加样量精密度 预防性维护口定期更换注射器口定期更换穆 瞳管 各实验室可根据具体情况制定本实验室稀释配液仪准备流程图 46 1 5 移液器准备 测定工作前，按已制定的s o p 文件对移液器进行检查，填写表1 0 表1 0 移液器谢定系统的准备 l准备事项具体内窖 应用前检查口温度口湿度口机身清洁口机械移动 仪器性能检查口加样量正确性口加样量精密度 预防性维护口定期进行保养口定期校准 各实验室可根据具体情况制定本实验室移液器准备流程图 4 616 天平准备 测定工作前，按已制定的s o p 文件对天平进行检查，填写表1 1 w s t3 5 2 2 0 表1 1 天平准备 准备事项 具体内容 开机前检查口电源巴打印机e 水平珠位置 开机自检口电量口零位显示 核实是否在国家计量机构检定合格有救期内 校准 大型实验前：标准砝码校准 每次应用前：仪器自带校准 开机注意事项口使用前清洁天平口电源充足 各实验室可根据具体情况制定本实验室天平准备流程图。 4 6 17 p h 计准备 铡定工作前，按已制定的s o p 文件对p h 计进行检查，填写表1 2 表1 2p h 计准备 准备事项具体内容 电嚣口接地e 电脑口打印机 开帆前检查 口温度口温度口机身清洁 温度探头：口与p h 计连接完整 电柱：口与p h 计连接完整口内彼的量口外液的置 组合磁力搅拌器： 巳电源 口接地口转速 磁力搅拌子；口完整口清洁度口磁力 o h 标准蒋液：口剩余量口有效期 每次应用前性能保证： 仅器性能保证 更换电极内液和电极外液进行电楹激恬 采用p h 标准溶液进行校准 应用前：口更换电极内液和电极外稚：电极激活 预防性维护应用后：口更换电极内液和电极外液：电极保养 口清洁温度探头、电极 各实验室可根据具体情况制定本实验室p h 计准备流程图 4 62 分析部分的准备 46 2 1 分析样本的类型 a l t 参考方法测定样本主要有： 参考物质( r m ) ； 质控品； 检测实验室送检样本； 其他样本。 w s t3 5 2 2 0 462 2 分析系列的结构 分析样本按下列顺序排列： 参考物质( r m ) 质控品； 空白样本，如：生理盐水； 被分析的“未知”物质。 上述样本重复铡定可减小测定结果不确定度。从一个样本到下一个样本的携带污染应小于 05 。 4 6 23 分析部分 a l t 参考方法测定的样本多为冻干粉或深低温的冰冻样本，测定前需处理为均匀的液状状态，分 析部分应取自该液体样本，实验室需对待铡的各种样本经过一定方法处理后，取出分析部分进行测定。 对每一类型实验室样本应制定详尽的样本处理s o p 文件，并有记录证实操作达到预期要求。实验 室样本若为冻干粉或干粉，应使用质量与双蒸水类似的高纯度水( 电导率 2p s c 1 3 1 ，p h 6 7 ，硅酸 盐 o1m g l _ 1 ) 溶解；若为冷冻液体如冰冻血清等，应按s o p 文件在严格控制的条件下溶解。 应有处理参考物质的方法和记录。 测定过的样本有贮存待复查、销毁的文件和记录。 47 酶催化活性浓度测定 4 71 测定条件 见表1 3 。 表1 3a l t 催化活性浓度测定条件 参数 指标 温度 3 7o 0 1 波长 带宽 2n 光径 1 0 0 0m m o 0 1m m 。 孵育时间 延迟时间 测定时间 读数( 测定点) 6 扩展不确定度“= 2 ) 。 4 7 2 测定步骤 4 7 2 1 监测比色杯内温度，达到要求时开始准备试剂和分析溶液 将一份适当体积( 约0 4m h ) 起始试剂溶液在3 7 平衡，剩余的起始试剂应保存在2 将43 2 中所列试剂体积按表1 4 的顺序加入到反应杯中。 表1 4 总体转换率测定的分析系统( a l t 催化反应速率和空白率) 体积 测定步骤 反应液 平衡至3 7 样本 充分混合并孵育3 0 0s 。在孵育结束时，反应杯中的溶液 温度应达到3 7 起始试剂溶藏 充分混合，等候9 0s ，监测另外1 8 0s 的时间和吸光度 注：此动态光度测定的扩展( = 2 ) 合成不确定度( 正态分布) 不应超过l 蹦。( 此不确定度不包括渡长酒整的不确 定度) 。样本体积分数的扩展强= 2 ) 合成不确定度( 正态分布) 应l “。 国ia l t 参考方法测定流程图 4 7 3 最终完全反应混和物的浓度 见表1 5 。 1 2 2 3m 既m； 表1 5a l t 催化活性浓度测定最终完全反应混合物的浓度 w s t3 5 2 2 0 参数指标 三羟甲基氨基甲烷 t r i s p h ( 3 7 ) l _ 丙氨酸 2 83 k a t l “( 17 0 0 u l _ 1 ) 2 酮戊二醯 样本体积比分 。扩展不确定度( 一2 ) 。 4 74 试剂空白辜测定 为了测定试剂空白率，用9g l _ 1 ( 1 5 4m m o l l 叫) n a c i 溶液代替样本，测定方法同472 。如 果试剂空白痒尔消光系数的绝对变化超过33 1 0 s ( 0 0 0 2r a i n _ 1 ) ，反应液应丢弃。 4 75 样本空白率测定 测定样本空白率，用9g l - 1 ( 1 5 4m m o l l 叫) n a c l 藩液代菩起始试剂溶液，测定方法同上； 注1 ：擐i 定样本空白率并作记录但在计算质控血清和枝准品中a l t 催生话性浓度时不予考虑。如果样率空日里 超过总a u 的l 时，应发出警告该物质不适合作校准用， 洼2 ：样本空白率的试剂空白可用9g l “n a c i 溶掖代替起始试剂溶液和样本进行测定。 476 结果确认 在进行重要测定前( 如给参考物质校准品赋值，测定室问比对标本等3 ，应先测定j c t l m 和( 或) 国家批准的参考物质，测定结果应在“靶值士不确定度”范围内，否则应确认建立方法的正确性。 实验室应有s o p 文件和记录证实此活动。 4 8 测定结果处理 4 8 1 测定结果计算及数据处理 4 81 1 计算 通过回归分析( 最小二乘法) 计算摩尔消光系数随时间的改变 s _ 1 ( r a i n _ 1 ) 。减去试剂空白率后， 即校正后的样本摩尔消光系数变化率。按公式( 2 ) 计算a l t 催化活性浓度： b a l t f ( a z x t ) m ( 2 ) 式中： 6 a l 。a l t 催化活性浓度，单位为微凯塔尔每升( t k a t l _ 1 ) 或单位每升( u l “) ； f 系数，等于19 0 5 ( 在3 3 9 1 1 1 3 波长测定时，瑚( n a d h ) = 6 3 0 m 2 m o l “) ； ( a 血) 札t 经过试剂空白率校正后的样本摩尔消光系数变化率，单位为每秒( s _ 1 ) 或每分 ( r a i n _ 1 ) 。 4 8 1 2 数据处理 4 8 1 21 数据剔除：必要时，每个实验室应建立适当的数据剔除规则 w s t3 5 2 2 0 1 1 4 8122 计算每批次测定值的均值、标准差，必要时应检查数据分布类型，计算均值的标准偏差( 标 准误) 。 4 8123 根据g u m 和q u a m 原则计算测定结果不确定度。 4 8 2 酶活性单位及换算关系 酶催化活性常用单位为k a t l ，使用时常出现多位小数，目前常以t - k a t l _ 1 或n k a t l _ 1 表 示t 但临床医学中仍习惯于使用u l 。换算关系如下： 以u l 叫单位表示的催化浓度可通过乘以系数( f - - 00 1 66 7 ) 转化成t x k a t l 。 4 9 分析可靠性 4 9 1 概念、价值爰其应用 应依据不确定度、精密度、线性范围、检出限等来评估a l t 参考方法的分析可靠性。相关文献及 参考方法的实验室测定数据表明本参考方法的分析性能优于f 临床酶活性浓度常规方法。适合于临床常 规方法的溯源。 49 2 测定不确定度 应根据g u m 和q u a m 原则计算测定不确定度。本参考方法测定结果的相对合成标准不确定度 在浓度1 67 t * k a t l 叫( 1 0 0u l 叫) 时宜小于2 。 4 93 精密度 应根据本实验室测定条件评估建立的参考方法的重复性、复现性精密度。本参考方法测定 16 7 t t k a t l _ 1 ( 1 0 0u l _ 1 ) 样本的重复性精密度宜小于1 5 “，实验室内复现性精密度宜小于 20 。 4 9 4 检出限 与分光光度计的最小分析信号有关。本参考方法测定的最低检出限为o0 8b l k a t l _ 1 ( 50u l _ 1 ) 。 4 9 5 线性范围 线性范围 4 7 6 t t k a t l _ 1 ( 2 8 5 8u l _ 1 ) 。 4 9 6 误差的来源 在孵育过程中，样本中高浓度的丙酮酸将导致n a d h 大量消耗，这样会减少测定范围的上限，并 大大降低测定结果。 4 1 0 通过实验室间比对进行确认 目前尚无a l t 催化活性浓度测定( 无磷酸吡哆醛) 参考方法的实验室问比对活动。 4 1 1 参考区间 初步调查男性与女性( 1 7 岁) 的参考区间。 男性： 下限( 第2 5 百分位) ：0 2 1 t t k a t l ( 1 2 6u l 叫) 1 4 上限( 第9 7 5 百分位) ：0 7 5 u k a t l ( 4 4 8u l _ 1 ) 女性： 下限( 第2 5 百分位) ：0 1 5 u k a t l _ 1 ( 92u l 叫) 上限( 第9 7 5 百分位) ：0 5 4 t - k a t l ( 3 2 3u l 一) 注：中国a l t 催化话性浓度( 元磷酸毗哆硅) 参考区间尚在调查中。 4 、1 2 报告 应设计适宜的测定结果报告格式，包括但不限于以下内容： 血清、血浆或其他； 取样日期和测定日期； 测定所使用的参考方法：i f c c 在3 7 下测定a l t 催化活性浓度的原级参考方法 被测定的名称、测定结果数字值和测定单位； 被测定的名称：a l 丁 测定单位：，k a t l 一或u l 叫 评定测定结果的不确定度：一般取 = 2 ； 样本异常特性记录：如溶血、黄疸、乳糜等； 测定方法的异常情况或改变测定方法记录。 4 1 3 质量保证 4 1 3 1 室内质量控制 每个工作日开始正式测定样本前均泓定质控品，当质控符合要求后才进入正式测定。应建立色捂 质控规则、操作步骤的室内厦控s o p 文件及记录。 4 ，1 32 室间质量控制评价 目前尚无a l t 催化活性浓度测定( 无磷酸吡哆醛) 参考方法的实验室间比对活动 4 1 33 质量日志 每个工作日完成工作日志及环境控制的质量记录。 a1 测定试剂 附录a ( 规范性附录) 测定储存酶溶液中l d 催化活性浓度 a 1 1 辅助试剂 a 1 1 1 一水5 一磷酸吡哆醛( p y r i d o x a i _ 5 | p h o s p h o r i ca c i d ，m o n o h y d r a t e ，p 一5p ) ( c 8 h on p h 2 0 ) ，相对分子质量一2 6 52 。 a 1 12 丙酮酸一钠盐( c 3 h 3 0 。n a ) ，相对分子质量一1 1 0 0 。 a 12 试剂制备 a 121 5 。磷酸吡哆醛溶液 称量1 67m g 一水5 l 磷酸吡哆醛，将上述物质按以下步骤处理： 溶于约6m l 溶液2 中； 一一转移至1 0m l 容量瓶中 将容量瓶和溶液2 平衡至2 0 ； 加溶液2 至容量瓶的校准刻度线( 2 0 ) ； 避光保存( 如装在棕色瓶) 。 最终配制的溶液中5 l 磷酸吡哆醛的浓度为63 0 0m m o l 。该溶液2 8 稳定性为1 周， a 1 22 测定l d 催化活性浓度的反应液的组成 分别移取1 00m l 溶液1 、02 0 0m l5 一磷酸吡哆醛溶液、02 0 0 m l 溶液3 、01 0 0 m l 水，将上述 溶液充分混匀、避光保存。该溶液2 8 稳定性为1d 。 a123 测定l d 催化话性浓度的起始试剂溶液 称量00 9 90g 丙酮酸一钠盐，将上述物质按以下步骤处理： 溶于约6m l 水中； 转移至2 5m l 容量瓶中； 将容量瓶和水平衡至2 0 ； 加水至容量瓶的校准刻度线( 2 0 ) 。 最终配制的溶液中丙酮酸一钠盐的浓度为3 60 0m m o l 。该溶液2 8 稳定性为1d 。 a 12 4 l d 储存液的稀释( 使用前进行) 示倒 a12 4 1 在1 0 0m l 酶试剂稀释液中加入0 0 5 0m ll d 储存液，充分混匀。第一步的稀释比例是 1 ：2 0 1 。 a 1 2 4 2 将步骤a1 2 41 中的0 0 5 0 m l 最终溶液加人到1 00m l 酶试剂稀释液中，充分混匀。 第二步的稀释比例是1 ：2 0 1 。第一步和第二步总稀释比例是1 ：4 04 0 l 。 注：所用l d 储存液催化括性浓度不同于上述步骤时稀释度不同，需要对稀释日子( 凡) 进行各自调整。 1 6 a2 测定条件 a 2 1 最终完全反应混合物的浓度 见表a 1 。 表a1l d 催化活性浓度测定最终完全反应混台物的浓度 w s t3 5 2 2 0 参数指标 三羟甲基氨基甲烷 t n s p h ( 3 7 ) l _ 丙氨酸 5 磷酸吡哆醛 丙酮酸 与反应混合液体积比分 扩展不确定度( f f i2 ) 。 a2 2 l d 催化活性浓度测定条件 见表a 2 。 表a 2l d 催化活性浓度测定条件 参数指标 温度 波长 带宽 ：2n m 光径 孵育时间 延迟时间 测定时间 读数( 测定点)6 。扩展不确定度( 一2 ) 。 a 3 测定步骤 a 3 1 试剂准备 将一份适当体积( 约04m l ) 的起始试剂在3 7 下平衡，为测定做准备。剩余的起始试剂保存在 w s t3 5 2 2 0 a 3 2 测定方法 按表a3 的顺序和量，将试剂和样本加入比色杯。 表a3l d 催化活性浓度测定步骤 体积 测定步骤 反应液 平衡到3 7 步骤a124 配制的l d 稀释液充分混句，孵育3 0s 。孵育结束时， 比色杯中溶液温度应达到3 7 起始试剂溶液充分混匀，等待3 03 后，再连续监测9 0s 的摩尔消光 系数 a3 3 试剂空白 用9g - l _ 1 ( 1 5 4m m o l l _ 1 ) n a c i 溶液代替l d 溶液测定试剂空白，按上述步骤进行操作 a4 计算 计算方法与a l t 催化活性浓度的计算方法相同。通过回归分析( 最小二乘法) 计算摩尔消光系数 随时间的改变 s _ 1 ( r a i n 叫) 。减去试剂空白率后，即l d 储存液稀释液的摩尔消光系数变化率。按公 式( a1 ) 计算储存酶溶液中l d 催化活性浓度： l d ，。d = f f 孙。( & a a t ) l d ( a1 ) 式中： l d 一储存酶溶液中l d 催化活性浓度，单位为微凯塔尔每升( b l k a t l _ 1 ) 或单位每升 ( u l 叫) ，单位z k a t l _ 1 除以10 0 0 可得m k a t l ，单位u l 一除以10 0 0 可得k u l ； f 系数，等于l9 0 5 ( 在3 3 9n m 波长测定时，m ( n a d h ) = 6 3 0m 2 m o l 叫) ； f “响。l d 储存液的稀释因子，本例中为4 04 0 1 ； ( a f ) l d 经过试剂空白率校正后的l d 储存液稀释液的摩尔消光系数变化率，单位为每秒 ( s 叫) 或每分( m i n - 1 ) 。 b1 试剂原料详细信息 附录b ( 瓷料性附录) 试剂原料详细信息 见表b1 表b 1 l 。 衰b1 试剂原料详细信息 试剂系统名三蔓堑e 薹量釜里量l 通用名! ! ! 一 信息指标内容 c a s ，c a r n 注册号 生产厂家 货号批号 分子卉c 4 h 【】n o 。 相对分子质量 纯度 特定音格要求( 如有) 危险度 贮存要求 失效期 试剂系统名呈至堕坠 表b 2 试剂原料详细信息 信息指标内容 c a s ，c a r n 注册号 生产厂家 货号批号 分子式 c 3 h7 n o z 相对分子质量 纯度 特定合格要求( 如有) 危险度 s 2 4 2 5 贮存要求 失效期 w s t3 5 2 2 0 表b3 试剂原料详细信息 试剂系统名三查三尘坠重三壁茎垦三盟盐一 信息指标内容 c a s ，c a r n 注册号 生产厂家 货号批号 分子式c 5 h o 。n a z 2 h 2 0 相对分子质量 纯度 特定台格要求( 如有) 危险度s 2 4 2 5 贮存要求 失效期 表b 4 试剂原料详细信息 试刑系统g 垂厦型壁塑壁堕竖竖堕三篮董墼三壁垫通用名旦皇里旦一 信息指标内容 c a s ，c a r n 注册号 生产厂家 货号批号 分子式c 2 i h 2 - n 7 0 1 t p 2 n a 2 相对分子质量 纯度 特定合格要求( 如有) 危险度$ 2 4 2 5 贮存要求 失效期 表b5 试剂原料详细信息 试剂系统名里堕盟鱼堕通用名! ! 旦 信息指标内容 c a s ，c a r n 注册号 生产厂家 货号批号 分子式 相对分子质量 纯度 特定合格要求( 如有)来源于猪的骨骼肌，保存在甘油中 危险度 贮存要求 失效期 试剂系统名叠氟钠 表b 6 试剂原料详细信息 w s t3 5 2 2 0 1 1 信息指标内容 c a s ，c a r n 注册号 生产厂寡 货号批号 分子式n a n 3 相对分子质量 纯度 特定合格要求( 如有) 危险度t + ，n ，r 2 8 ，r 3 2 ，r 5 0 5 3 ，$ 2 8 a ，s 4 5 ，$ 6 0 ，s 6 1 贮存要求 失效期 试剂系统名盐酸 表b7 试剂原料详细信息 c a sc a r n 注册号 7 5 4 7 - 0 lo 生产厂家 货号批号 分子式 相对分子质量 纯度 特定合格要求( 如有) 危险度 贮存要求 失效期 试剂系统名墨堑些盟 表b8 试剂原料详细信息 信息指标内容 c a s ，c a r n 注册号 生产厂家 货号批号 分子式 栏对分子质量 纯度 特定合格要求( 如有) 危险度c r 3 5 ，s z 4 2 5 ，s 3 7 3 9 s 4 5 贮存要求 失效期 试剂系统名鱼鲨塑 表b 9 试剂原料详细信息 信息指标内容 c a s ，c a r n 注册号 生产