细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳（888）.ppt

细胞凋亡的DNA 琼脂糖凝胶电泳,1,医学知识,细胞凋亡（apoptosis/programmed cell death） 细胞凋亡是为维持内环境稳定，一个由基因控制的主动的有序的死亡过程，凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。 生物学意义： 确保正常发育生长：清除多余的细胞 维持内环境稳定：清除受损、突变、衰老的细胞 积极防御功能：对病毒感染细胞阻止复制,2,医学知识,3,医学知识,细胞凋亡过程中的形态学改变,细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离。 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆。 核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段。 凋亡小体形成。但无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。,4,医学知识,5,医学知识,其中最重要和最具有特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成以180200 bp为最小单位的单体或寡聚体片段。,6,医学知识,凋亡和坏死的区别,坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞 胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。 凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。,7,医学知识,凋亡和坏死的形态学特征,8,医学知识,实验原理,本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞DNA在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细胞染色质DNA在核小体连接处断裂，形成180-200 bp或其整倍数的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯状电泳图谱(DNA ladder)，而坏死细胞或凋亡后期的继发性坏死细胞DNA电泳后则成模糊的“涂片状” 。,9,医学知识,材 料,1. 凋亡细胞：经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞 2. 提取DNA：基因组DNA抽提试剂盒（RNA酶、蛋白酶K、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、DNA ladder 标准品等） 3. DNA电泳：1 %的琼脂糖凝胶、点样缓冲液 4. 实验器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、台式高速离心机、65水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透射仪,10,医学知识,方 法,一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含510%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨，将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm，离心5min，制成1107细胞悬液备用。,11,医学知识,二、提取胸腺细胞DNA： 裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液） 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入100lL液和20lA液，充分混匀，置于55温浴20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。,12,医学知识,(2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、3MNaAC, pH4.8) 加入10l 3MNaAC，随后加入1250l B液，充分振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次同上，静置1分钟，离心30s。,13,医学知识,(3)漂洗阶段（使用试剂：600ul漂洗缓冲液2=W液） 倒掉收集管中的废液，再加入600ulW液，12000rpm离心30秒。 重复上叙步骤，再次加入600 ulW液，12000rpm离心30秒。 倒掉废液，再次12000rpm离心30秒。,14,医学知识,(4) 洗脱收获（使用试剂：50l洗脱缓冲液=T液） 小心取出离心吸附柱（不可沾上W液，因其中含有乙醇，会使提取DNA变性），将其套入一个干净的1.5ml eppendorf管中，沿吸附柱的正中间小心加入50l T液，静置1分钟后，于12000rpm离心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因组DNA, 取10l电泳。,15,医学知识,三、DNA琼脂糖凝胶电泳： (5)制板: 将1 %的琼脂糖凝胶加热溶化，取20ml倒板, 待凝, 取梳。置板于电泳槽中，加电泳缓冲液至淹没过胶。 (6) 加样：取50 uL DNA样品与10uL点样缓冲液,混匀, 10ul/孔。（DNA marker 直接加样，5 ul/孔）。,16,医学知识,(7) 电泳：点样孔置负极，电压80-100V，电泳至溴酚兰移出2/3距离时，关闭电源。 (8) 观察：取出凝胶板，置紫外透射仪上，可见绿色DNA区带。,17,医学知识,注意事项： a 步骤2中，加入B液后一定要充分混匀。离心后，小心取出上清，Tips头不可吸附上白色沉淀（为基因组蛋白）。 b 漂洗阶段（步骤3）一定要离心充分去除漂洗缓冲液，可适当将离心时间延长。 c 洗脱缓冲液一定要保证加入到吸附柱中央。,18,医学知识,结果观察,加地塞米松培养的胸腺细胞DNA电泳后呈典型的“阶梯状”条带。未加地塞米松培养的胸腺细胞，DNA无类似改变。细胞坏死对照的DNA电泳呈现弥漫的片状图谱。,19,医学知识,地塞米松诱导小鼠胸腺 细胞凋亡 1： DNA marker; 2-3：细胞坏死对照 4-6：细胞凋亡； 7： 正常细胞对照,20,医学知识,基因组DNA抽提试剂盒,SDS（十二烷基硫酸钠）：破细胞膜、核膜，使组织蛋白与DNA分离 EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA不再降解 Proteinase K：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小肽/氨基酸 酚、氯仿：抽提除去蛋白质 异丙醇：沉淀DNA Goldview：DNA萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫外光下呈绿色萤光,21,医学知识,22,医学知识,TNF receptor-associated death domain (TRADD) Fas-associated death domain protein (FADD) cysteine-aspartic proteases（caspase）,23,医学知识,24,医学知识,细胞凋亡的检测,细胞形态的改变 DNA片段 检测caspase，裂解的底物，调节因子和抑制因子 细胞膜的改变 线粒体改变,25,医学知识,细胞形态的改变,电镜检测： 可检测单个凋亡细胞的变化，但细胞凋亡早期无明显形态学变化的，需做其他实验证实。,26,医学知识,正常胸腺细胞,凋亡胸腺细胞,27,医学知识,凋亡的淋巴细胞,凋亡的淋巴细胞 被巨噬细胞吞噬,28,医学知识,DNA片段的检测,DNA琼脂糖凝胶电泳 TUNEL法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）： 基本原理：存在于DNA上的切口可被末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）识别，这种酶将催化dUTP添加到切口上，dUTP继而可被其它标志物所标记。此法亦可用于标记遭到严重DNA损伤的细胞。,TUNEL染色法展示出小鼠肝脏中的一个凋亡细胞,29,医学知识,Caspase等凋亡相关因子检测,western blot, immunoprecipitation Immunohistochemistry Apoptosis PCR microarray Apoptotic or anti-apoptotic regulator proteins such as Bax, Bid, and Bcl-2 can also be detected using fluorescence and confocal microscopy,30,医学知识,检测细胞膜的改变,Annexin V 基本原理：正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。,31,医学知识,线粒体的改变,线粒