YC-T150-2002烟草种子转基因的测定.pdf

I C S 6 5 . 1 6 0x 8 5备案号: 1 0 5 8 7 -2 0 0 2中 华 人 民 共 和 国 烟 草 行 业 标 准 Y C / T 1 5 0 -2 0 0 2烟草种子转基因的测定T o b a c c o s e e d -D e t e r mi n a t i o n o f g e n e t i c a l l y mo d i f i e do r g a nis m2 0 0 2 一 0 9 一 1 2发布2 0 0 2 一 1 2 一 0 1实施国家烟草专卖局发 布65 7Y C / T 1 5 0 -2 0 0 2前言本标准由全国烟草标准化委员会农业分技术委员会提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。本标准起草单位: 中国烟草东北农业试验站。本标准主要起草人: 焦庆明、 郭兆奎、 闺新甫、 万秀清、 于艳华、 魏继承。Y C / T 1 5 0 -2 0 0 2烟草种子转基因的测定1 范围 本标准规定了烟草种子转基因的测定方法。 本标准适用于烟草种子。2 引用标准 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。 凡是注日 期的引用文件， 其随后所有的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 Y C / T 1 4 9 -2 0 0 2 烟草及烟草制品 转基因的测定3 术语 应符合Y C / T 1 4 9 -2 0 0 2 第 2 章的规定。4 实验室要求 应符合Y C / T 1 4 9 -2 0 0 2 第 3 章的要求。5 试剂 应符合Y C / T 1 4 9 -2 0 0 2 第 4 章的要求。6 仪器与耗材 应符合Y C / T 1 4 9 -2 0 0 2 第 5 章的要求。7 样品的取样方法 以品种为单位， 即每个品种作为一个样品， 对虽为同一品种， 但种子产地或种子生产年份不同， 也作为单一样品取样， 每一样品随机多点取样1 0 g ， 样品编号注明品种名称、 种子产地和生产年份。8 D N A提取8 . 1 前处理 随机取烟草种子。 . 5 g 放人装有滤纸保湿的培养皿中， 2 8 光照下培养5 d ， 种子萌发出苗后， 用滤纸吸出表面水分。8 . 2 D N A提取8 . 2 . 1 种子萌发后提取8 . 2 . 1 . 1 种子萌发幼苗称量约3 0 0 m g ， 在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉末， 装人1 . 5 m l ， 离心管中。8 . 2 . 1 . 2 取3 0 0 m g 液氮研磨后的粉末， 加入2 0 0 p l . 2 X C T A B提取缓冲液， 充分混匀后， 6 5 C 水浴1 0 mi n ,82 . 1 . 3加人等体积的三氯甲烷 : 异戊醇( 2 4 e 1 ) ， 混合均匀 1 2 0 0 0 r / mi n离心4 m i n .Y C / T 1 5 0 -2 0 0 28 . 2 . 1 . 4 取上清液， 加 1 / 1 。体积的 1 0 %C T A B提取缓冲液， 加人等体积的三抓甲烷 : 异戊醇( 2 4 : 1 ) , 混合均匀后1 2 0 0 0 g 离心4 m i n ,8 . 2 . 1 . 5 取上清， 加等体积的C T A B沉淀缓冲液， 混匀 1 5 0 0 0 r / m i n离心8 m i n ,8 . 2 . 1 . 6 去上清， 沉淀加 1 0 0 u L高盐T E缓冲液， 6 5 水浴1 0 m i n ,8 . 2 . 1 . 7 加人二倍体积冷无水乙醇， 于一4 0 C 下 3 0 mi n ,8 . 2 . 18 i s o o o g 离心8 m i n ， 沉淀溶于7 0 IA - 超纯水中。8 . 2 . 2 种子未经萌发直接提取8 . 2 . 2 . 1 将烟草种子浸泡于无菌水中过夜或放人6 5 C 水中1 h ， 取1 0 0 m g 膨涨的种子放人2 m L离心管中捣碎， 加人5 0 o 讨. 1 X C T A B抽提缓冲液， 剧烈振荡混合均匀后放人6 5 C 的恒温水浴中3 0 m i n 。 再1 2 0 0 0 g 离心 1 0 mi n .8 . 2 - 2 . 2 取上清液， 加2 0 0 1, L三氯甲烷混合均匀， 1 2 0 0 0 r / m i n 离心 1 0 m i n ,8 . 2 - 2 . 3 取上清液， 加2 倍体积的C T A B沉淀缓冲液， 室温下1 h , 1 2 0 0 0 g 离心5 m i n ,8 . 2 . 2 . 4 去上清液， 沉淀加人3 5 0 川 高盐T E缓冲液， 加3 5 0 川 三抓甲 烷混合3 0 s ， 离心1 0 m i n .8 . 2 . 2 . 5 取上清液， 加 0 . 6 倍体积异戊醇 1 2 0 0 0 r / m i n离心 1 0 m i n ,8 . 2 - 2 . 6 去上清液， 沉淀加人 5 0 0 p L乙醇轻微振荡并混合均匀， 1 5 0 0 0 r / m i n离心 1 0 m i n ， 沉淀溶于5 0 1, 1 超纯水中。8 . 3 D N A含f和纯度的测定 应符合Y C / T 1 4 9 - - 2 0 0 2 第 7 . 3 条的规定。9 P C R检测应符合 Y C / T 1 4 9 -2 0 0 2 第 8 章的规定。烟草种子的卡那，寮抗性法测定把每份种子样品分别放人 1 . 5 mL的离心管中。管内加 1 . 0 m l , 7 0 %的无水乙醇， 然后立即用灭菌的移液器将无水乙醇吸出。管内加人 1 . 0 m L次氯酸钠， 保持3 0 m i n ， 期间正反混合均匀几次， 然后将液体用移液器吸出。用灭菌水清洗四次。取一个 1 M I ， 的枪头， 将枪头剪开， 使种子能从离心管中吸出， 移到1 / 2 MS培养基上光照培养。将萌发的种子转移到分别含有质量分数为。 p g / g , 5 0 p g / g , 1 0 0 p g / g 卡那霉素的1 / 2 MS 培养基 JlnJ走J刀月J亡U