YC-T 149-2002 烟草及烟草制品 转基因的测定.pdf

i c s 6 5 . 1 6 0% 8 5备案号: 1 0 5 8 6 -2 0 0 2中 华 人 民 共 和 国 烟 草 行 业 标 准 Y C / T 1 4 9 -2 0 0 2烟草及烟草制品转基因的测定 T o b a c c o a n d i t s p r o d u c t -D e t e r mi n a t i o n o f g e n e t i c a l l y m o d i f i e d o r g a n i s m2 0 0 2 一 0 9 门2发布2 0 0 2 一 1 2 一 0 1 实施国家烟草专卖局发 布6 4 7Y C / T 1 4 9 -2 0 0 2前言本标准由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会提出。本标准由全国烟草标准化技术委员会归口。本标准起草单位: 中国烟草东北农业试验站。本标准主要起草人: 焦庆明、 郭兆奎、 闻新甫、 万秀清、 于艳华、 魏继承。Y C / T 1 4 9 -2 0 0 2烟草及烟草制品转基因的测定范 围本标准规定了烟草及烟草制品转基因的测定方法。本标准适用于烟草及烟草制品。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2 . 1 基因工程 g e n e t i c e n g i n e e r i n g 利用载体系统的重组D N A技术， 以及利用物理、 化学和生物等方法把重组 D N A导人有机体的技术。2 . 2 转基因烟革 g e n e t i c a l l y m o d i f i e d t o b a c c o 利用基因工程的遗传操作获得的烟草， 不包括自 然发生、 人工选择和杂交育种技术得到的烟草; 不包括化学或物理方法诱变得到的烟草; 不包括通过器官、 组织或细胞培养及原生质体融合、 染色体倍性操作得到的烟草。3 实验室要求3 . 1 实验室空间设计 应在相互隔离的不同实验室进行样品前处理、 D N A提取、 P C R反应、 试剂配制和凝胶观察等操作，并定期对实验室进行紫外过夜照射。3 . 2 操作要求 试验室台面使用前后利用次抓酸钠擦拭消毒; 样品研磨在强力通风橱中进行; P C R反应液加样在超净工作台内进行; 样品准备过程中每个样品操作更换一次塑料手套; 样品的称量不可在称量试剂的天平室内进行， 应设专用天平以免污染试剂。3 . 3 样品皿盆 将每个待测样品随机分成两组， 每组分别进行D N A提取和P C R分析。3 . 4 对照样品3 . 4 . 1 阳性对照 阳性标准样品是配制为已知含量的转基因烟草样品， 确定其含量分别为 0 . 1 %. 0 . 5 0 o , 1 %. 2 写、s %e3 . 4 . 2 阴性对照 阴性对照是事先检测为非转基因的烟草样品。3 . 4 . 3 试荆对照 该对照中不含烟草样品， 与样品一起利用相同的程序进行各种试剂的处理操作， 用以控制反应试剂对试验结果的影响。Y C / T 1 4 9 -2 0 0 23 . 4 . 4 提取空白 从样品研磨到提取结束， 将两个离心管放在工作区内， 与样品D N A一起进行P C R扩增， 以确定交叉污染的可能性。3 . 5 P C R扩增结果观察 在每一次P C R反应中， 只有当所有的对照都表现正常时， 才能认可电泳结果， 此时阳性样品在特定位置出现一条带， 而其他位置及阴性对照和空白对照都没有扩增条带。若任何对照出现异常， 要重新进行检测， 以避免假性结果。3 . 6 防止污染 所有用于提取D N A和P C R扩增的耗材、 用具使用前都必须进行灭菌处理， 移液器枪头和各种离心管只能一次性使用， 工作台面和操作间用过后进行紫外线过夜照射， 样品前处理及研磨要在通风橱中进行， 并带一次性手套.3 . 了 安全防护 在整个试验操作过程中都必须穿着工作服和手套， 特别在接触E B时应带抗化学腐蚀的手套及口罩。4 试荆 4 . 1 化学试荆 以下试剂均为分析纯以上纯度等级。4 . 1 . 1 十六烷基三甲基澳化胺C T A B ,4 . 1 . 2 三抓甲烷。4 . 1 . 3 乙二胺四乙酸二钠N a z E D T A,4 . 1 . 4 乙醇。4 . 1 . 5 抓化钠。4 . 1 . 6 三经甲基氨基甲 综碱T r i s B a s e ,4 . 1 . 7 乙烯毗咯烷酮P V P - 4 0 ,4 . 1 . 8 异戊醇。4 . ， . 9 琼脂糖。4 . 1 . 1 0 硼酸。4 . 1 . 1 1 嗅酚蓝。4 . 1 . 1 2 冰乙酸。4 . 1 . 1 3 澳乙锭.4 . 1 . 1 4 乙酸钠。4 . 1 . 1 5 盐酸。4 . 1 . 1 6 柠檬酸钠。4 . 1 . 1 7 十二烷基硫酸钠S D S ,4 . 2 生物化学试剂4 . 2 . 1 P C R M a r k e r ,4 . 2 . 2 T a q D N A酶2 u / m L ,4 . 2 . 3 限制性内切酶A s p 7 0 0 ( X m n l ) , N s i l ,4 . 3 缓冲液4 . 3 . 1 C T A B 提取缓冲 液( p H 8 ) 含C T A B ( q = 2 0 g / L ) , N a C I ( c =1 . 4 m o l / L ) , T r i s ( c = 0 . 1 m o l / L ) 和N a 2 E D T A( c =2 0 mm o l / L ) a4 . 3 . 2 C T A B 沉淀缓冲液含C T A B ( q =5 g / I ) 和N a C I ( c = 0 . 0 4 m o l / L ) ,4 . 3 . 3 高盐 T E含 N a C l ( c =1 . 2 mo l / L )Y C / T 1 4 9 -2 0 0 24 . 3 . 4 D N T P s 含d A T P , d C T P , d T T P和d G T P各2 . 5 m m o l / L ,4 . 3 . 5 A E缓冲液( p H 7 . 8 5 ) 含T r i s ( c = 4 0 m m o l 儿) 、 乙酸钠( c 二2 0 m m o i / L ) 和N a , E D T A ( c =2 mmo l / L ) ,4 . 3 . 6 T B E缓冲液( p H 8 . 0 ) 含T r i s / 翻酸( c =4 5 m m o l / L ) 和N a , E D T A ( c =1 m m o l / L ) ,4 . 3 . 7 标记的D N A探针。4 . 3 . 8 2 X S S C缓冲液( p H 7 . 0 ) 含N a C l ( c =3 m o l / L ) 和乙酸钠( c =0 . 5 m o l / L ) .4 . 3 . 9 预杂交液( 5 倍液, p H 7 . 0 ) 含N - s a r c o s i n ( q =1 g / L ) 和S D S ( q =0 . 2 g / L ) ,4 . 3 - 1 0 洗膜液1 ， S S C缓冲液( 2 倍液， p H 7 . 0 ) 含N a C I ( c =3 m o l / L ) 、 乙酸钠( c =0 . 3 m o l / L ) 和S D S( q 二1 g / l ) 。4 . 3 , 1 1 洗膜液2 , S S C缓冲液( 0 . 1 倍液， p H 7 . 0 ) 含N a C l ( c =3 m o l / L ) 、 乙酸钠( c =0 . 3 m o t / L ) 和S D S ( q 二1 g / L ) ,5 仪器与耗材5 门 商速冷冻离心机( 最高转数3 0 0 0 0 r / m i n )5 . 2 涡旋振荡器5 . 3 紫外分光光度计5 . 4 恒温水浴锅5 . 5 电子分析夭平( 感量0 . 0 0 0 1 g )56 微量离心机5 . 7 P C R仪5 . 8 电泳系统5 . 9 紫外分析仪5 . 1 0 恒温水浴锅5 . 1 1 尼龙膜5 . 1 2 杂交箱5 . 1 3 2 m L离心管5 . 1 4 移液枪头5 . 1 5 0 . 2 0 m L薄壁P C R反应管6 样品的取样方法6 . 1 鲜烟叶 以品种和种子产地为取样单位， 随机取样， 每个样品在1 0 个不同地块各取一个嫩芽或叶片， 自 然失水2 d 后， 编号注明品种名称、 种子来源、 取样地点。6 . 2 初烤烟( 把烟)6 . 2 . 1 数. 以检验批( 产地) 为单位， 每一检验批的产地和等级应是相同的， 5 0 件以下取2 件， 5 1 -1 0 。 件取4 件， 1 0 1 - 1 5 0 件取5 件， 1 5 1 - - 2 0 0 件取6 件， 2 0 0 件以上每增加5 0 件( 不足5 0 件按5 0 件计) 增取1件， 各取叶片少许， 混合作为一个样品。6 . 2 . 2 方法 打开一件烟叶的一端， 分左中右三个部位用长筒状取样器( 具尖筒内径 I c m) 随机取3 点， 该批次的每件所取的样品用四分法缩分出均匀样品2 份( 每份2 5 0 9 ) 作实验室样品供检验和复检， 实验室样品必须密封并填写标签， 注明产地、 等级报验号、 送样单位、 取样人。v C / T 1 4 9 - - 2 0 0 26 . 3 机打片烟 对于已装箱的机打片烟， 以箱( 内装 2 0 0 k g 烟叶) 为取样单位， 用长筒状取样器， 每箱随机取约2 g烟叶， 将每个集装箱的9 9 箱烟叶所取的近2 0 0 g 烟叶作为一个检测样品; 也可在复烤加工车间， 结合水分测定取样， 注明烟叶产地、 等级和箱号。6 . 4 卷烟 按照I S O 8 2 4 3 卷烟抽样 中规定的方法进行抽样。7 烟叶样品 D N A提取方法7 门样品前处理7 . 1 . 1 鲜烟叶 随机取鲜叶 样品约1 g ， 在研钵内 加液氮研磨成粉末， 转人称量的1 . 5 m L离心管中。 再称量确定叶片组织质量。7 . 1 . 2 烤后烟叶 随机取烟叶样品约2 0 g ， 用硫酸纸包好， 放人纸袋中， 置方盘加盖后， 4 0 C 恒温箱中过夜使其干燥，在灭菌的研钵中研成粉末， 存于2 0 ml ) 离心管中， 从中取约 1 0 0 m g 分别放人两个 l . 5 m l离心管中。7 . 2 D N A提取7 . 2 . 1 鲜烟叶7 . 2 . 1 . 1 取1 0 0 m g 液氮研磨后的粉末， 加人1 0 0 p L 2 X C T A B 提取缓冲液， 充分混匀后在6 5 C 中水浴1 0 mi n .7 . 2 . 12 加人等体积的三氯甲烷/ 异戊醇( 体积分数为2 4: 1 ) , 混匀后在 1 2 0 0 0 r / m i n离心4 m i n .7 . 2 . 1 . 3 取上清液， 加1 / 1 。 体积的1 o X C T A B 提取缓冲 液， 加人等 体积的三抓甲 烷/ 异戊博( 体积分数为2 4 : 1 ) , 混匀在1 2 0 0 0 r / m i n 下离心4 m i n .7 . 2 . 1 . 4 取上清， 加等体积C T A B沉淀缓冲液， 混匀1 5 0 0 0 r / m i n 下离心8 m i n .72 . 1 . 5 去上 清， 沉淀加1 0 0 t d高盐T E , 6 5 C 水浴1 0 m i n .7 . 2 . 1 . 6 加人二倍体积的冷无水乙醇( -2 0 C冰箱贮存) , -4 0 C 冷置3 0 m i n .7 . 2 . 1 . 7 1 5 0 0 0 r / m i n 离心8 m i n ， 沉淀溶于7 0 p, 超纯水中。了 . 2 . 2 烤后烟叶7 . 2 . 2 . 1 向内盛待测样品的1 . 5 m l离心管中， 加人7 0 0 p 1 . 0 . 7 5 X C T A B抽提缓冲液， 振荡混匀后，6 5 Y 的恒温水浴 1 0 m i n7 . 2 . 2 - 2 加7 0 0 1, 1三氯甲烷/ 异戊醇( 体积分数为2 4 : 1 ) , 混匀1 2 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n ,7 . 2 . 23 取上清液， 加1 / 1 。 体积的l O Yo C T A B 提取缓冲液， 加人等体积的三抓甲 烷/ 异戊醉( 体积分数为2 4 : 1 ) , 混匀后在1 2 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n ,7 . 2 - 2 . 4 取上清， 加等体积的C T A B沉淀缓冲液， 混匀后在 1 5 0 0 0 r / m i n离心8 m i n ,7 - 2 . 2 . 5 去上清， 加1 0 0 p I 一 高盐T E 缓冲液， 6 5 C 水浴1 0 m i n a7 . 2 - 2 . 6 加人二倍体积冷无水乙醇， 于一4 0 C 冷置3 0 m i n .7 . 2 - 2 . 7 1 5 0 0 0 r / m i n 离心8 m i n ， 沉淀溶于5 0 p L 超纯水中。7 . 3 D N A含f和纯度的测定7 . 3 . 1 紫外区波长扫描 烟叶D N A提取物的产量和纯度用紫外分光光度计波长在2 2 0 n m-3 2 0 n m之间扫描测定。7 . 3 . 1 门用超纯水将紫外分光光度计调零， 校正基线。7 . 11 . 2 将1 0 p 1 _ D N A提取液加人比色皿中， 加超纯水1 9 9 0 可 后， 移液器抽打混匀， 进行2 2 0 n m -3 2 0 n m波长扫描。7 . 3 . 1 . 3 提取的D N A产量以2 6 0 n m下的吸光值来计算, O D值为 I 相当于每毫升溶液中含有 s o p g双链 r N nY C / T 1 4 9 -2 0 0 27 . 3 - 1 . 4 D N A提取物纯度用O D 2 6 0 / 2 8 。 的值来估算， 比值在1 . 7 -1 . 9 为纯度较好， 比值大于1 1 9 提取的D N A中含R N A， 比值小于 1 . 7 提取液中含一些蛋白质等杂质， 要重新提取D N Ao7 . 3 . 2 硝酸还原酶基因序列P C R扩增 所提取 D N A质量可通过对其进行硝酸还原酶基因序列扩增来判定， 引物序列为: NR- 1 GTG TC A TGA AC A GAT GGC TC NR- 2 GAT TAC TCG TCG AGT GAA GA 利用此引物扩增出来的硝酸还原酶基因序列长度为 1 0 4 b y ， 来确定提取的D N A能否作模板用于检测。8 转基因烟叶检测方法8 . 1 共有序列引物的P C R检测8 . 1 . 1 引物设计 用于转基因烟草检测共有标志主要有: 花耶菜花叶病毒3 5 S 启动子、 根癌农杆菌n o s 终止子序列和编码卡那霉素抗性基因( N P T I D， 根据这些核甘酸序列设计P C R引物进行烟草转基因检测。8 . 1 . 1 门3 5 S启动子序列扩增 3 5 S - 1 5 GC T C C TA C AAAT G C C AT C A- 3 3 5 S - 2 5 GA TA GT G GGA TT G TG C GT C A- 3 该引物的扩增片段长度为 1 9 5 b y ， 作为转基因烟草检测的标志。8 . 1 . 1 . 2 n o s 终止子序列扩增n o s - 1 5 GATTGAAT C C TGTTGC C GGT - 3 n o s - 2 5 GTAACATAGATGACACCGC G- 3 该引物的扩增片段长度为2 1 3 帅， 作为转基因烟草检测的标志。8 . 1 - 1 . 3 N P T I I 基因序列扩增 NP T- 1 5 G C C C TG A A T G A A C TG C AG GA C GAG GC - 3 NP T- 2 5 GC AGGC ATC GC C AT GGGTC AC GAC GA- 3 该引物的扩增片段长度为4 1 1 b y ， 也可作为转基因烟草检测的标志。8 . 1 . 2 P C R扩增体系 对于3 5 S启动子序列引物3 5 S - 1 , 3 5 S - 2 和n o s 终止子引物n o s - l , n o s - 2 和N P T - 1 , N P T - 2 可采用下列扩增体系进行扩增反应， 按下列体系的摩尔数或浓度， 根据所作扩增的管数， 计算出各组分应加的总体积， 在无菌室中加样， 再分装至各个。2 0 mL扩增管中， 然后按体系中模板设计的纳克数加人模板， 加矿物油离心后放人P C R仪中扩增。 表 1 P C R扩增体系加 样 顺 序反 应 组 分浓度或体积( 每个反应管)11 0 又b u f f e r5 1, 1 .2d NTP s2 2 0 p mo l3引物 I2 5 p m o l4引物 22 5 p mo l5T a y FN超 纯 水 1U3 7 3 8 0 l .67D NA棋板3 0 0 n g总体积5 门P LY C / T 1 4 9 -2 0 0 28 . 1 . 3 P C R扩增条件 对于 3 5 S启动子序列引物3 5 S - 1 , 3 5 S - 2 和n o s 终止子引物n o s - l , n o s - 2 和N P T - 1 , N P T - 2 可采用下列循环程序进行扩增: 预变性: 9 5 C 下5 m i n ; 循环设定: 变性9 4 C, 3 0 s ; 退火6 4 C, 4 5 s ; 延伸7 2 C, 4 5 s ; 循环次数: 3 5 个循环; 后延伸: 7 2 C , 5 m i n ,8 . 1 . 4 电泳及凝肢观察 称 琼脂糖溶于0 . 5 X T B E 缓冲 液中。 溶化制成1 . 5 % 凝胶， 加E B ( 0 . 5 p g / m L ) , 温度降至4 5 C 时倒人放有梳子的凝胶模具中， 冷凝后拔出梳子， 放人水平电泳槽中， 取1 0 M L扩增产物加上样缓冲液( 含澳酚蓝指示剂) 点样， 以P C R Ma r k e r 作为分子量标记进行电泳， 紫外分析仪观察电泳结果。8 . 2 特异性落因序列的P C R检测8 . 2 . 1 烟草普通花叶病毒外壳蛋白甚因T M V - C PT MVI 5 G T G T T C T T G T C A T C A G C G T G G G C - 3 TMV2 5 C AC C GTTGC GTC GT CTAC T CTAC G- 3 其P C R扩增产物片段长度为2 0 2 b y8 . 2 . 2 黄瓜花叶病套外壳蛋白鑫因( C MV - C P ) C MV 1 5 - AC C CAAC CTTTGTAGGGAGTGAGC G- 3 C MV2 5 - AC A T AGC AGA GAT GG C G GC AAC G - 3 其P C R扩增产物片段长度为2 6 3 b p ,8 . 2 . 3 马铃甚Y病每外壳蛋白鑫因( P V Y - C P ) P VY 1 5 - GATATTT CAAATAC TC GGGCA- 3 P VY 2 5 - G C AT A A C G C G C T A AA C C C A C - 3 其P C R扩增产物片段长度为3 6 2 b p ,8 . 2 . 4 烟草普通花叶病毒盆制阵谷因( T M V 5 4 K D ) T5 4 D1 5 - GAGT T GT C T G GC AT C ATT GA- 3 T5 4 D2 5 - AC AAT G GT C AA AGC C G G GT A- 3 其P C R扩增产物片段长度为2 9 5 b p ,8 . 2 . 5 苏云金杆菌杀虫遥白荃因( B T ) B T - 1 5 C C C A C T AGT TAAC AAT TT GA T TG GA- 3 B T - 2 5 C C G GA A G C T T T A G GA C T G T A G G T - 3 其P C R扩增产物片段长度为2 9 9 6 p ,83 结果验证试验 如果样品的3 5 S启动子和( 或) n o s 终止子序列引物的P C R扩增出现阳性条带， 在重新提取D N A,重复前述P C R检测的同时应进行结果验证试验。8 . 3 . 1 限制性内切醉醉切反应验证8 . 3 . 1 . 1 P C R产物的纯化 将P C R产物移人另一灭菌的1 . 5 m L离心管中， 加 1 0 0 p L预冷的无水乙醇， 沉淀P C R产物D N A片段， 一8 0 冷冻 1 h 后， 1 5 0 0 0 r / m i n 离心 8 m i n ， 弃上清， 乙醇挥发后加超纯水。Y C / T 1 4 9 -2 0 0 28 . 3 . 1 . 2 酶切反应8 . 3 - 1 - 2 . 1 3 5 S 启动子 对于出现3 5 S P C R阳性反应样品， 应通过A s p 7 0 0 ( X m n 1 ) 进行限制性内切酶酶切分析， 方法是加5 u 的A s p 7 0 0 到1 0 m L经纯化的P C R产物中， 在3 7 C 恒温水浴中培养3 h ， 再进行1 . 2 写琼脂糖电泳和紫外分析， 如其 1 9 5 b y片段可被酶切成1 1 5 b y和8 0 b y ， 则可确定为3 5 S特异性扩增产物。8 . 3 . 1 . 2 . 2 n o s 终止子 对于呈n o s 引物P C R阳性反应的样品， 利用限制性内切酶N s i l 可将 1 8 0 b y 的片段切成 9 6 b y 和8 4 b y 的两条片段， 方法与3 5 S的酶切反应相同。8 . 3 . 2 撰式或半摸式P C R反应验证 对于P C R扩增片段亮度很弱或未出现的样品. 应采用巢式或半巢式P C R方法设计引物对扩增产物进行第二次P C R反应， 以提高检测的灵敏度。 巢式或半巢式P C R方法中， 第二次扩增是以第一次扩增的产物为模板， 引物的设计是根据第一次扩增产物目标基因序列， 使第二次扩增范围在第一次扩增片段范围内。8 . 3 - 2 . 1 3 5 s撰式P C R 3 5 S 巢式P C R扩增产物片段长度为1 1 o 6 p , 3 5 S - n t - 1 5 C GTTC AC C C TAAC TAC AC TAT- 3 3 5 S - n t - 2 5 GT GAC T GC C G T C T 0 0 0TA GA- 3 8 . 3 - 2 . 2 3 5 s半撰式 P C R 在3 5 S 半巢式P C R反应中第二次P C R中的一个引物与第一次P C R相同， 另一引物位于第一次扩增片 段内部， 其扩增产物片 段长度为1 3 4 b p . 3 5 S - s n - 1 5 A C A G T G G T C C C A A A G A T G G A - 3 3 5 S - s n - 2 5 GA TA GTT GG GAT T GT G C GT C A- 3 8 . 12 . 3 n o s 终止子橄式P C R 以 第一次扩增产物为模板， 利用下面一对引物进行第二次扩增， 扩增片段长度为1 0 4 6 p , n o s - NT - 1 5 G AAT C C T GT T GC C GGT C TT G- 3 n o s - NT - 2 5 0 0 0 A TC T C AT AAAT AAC GT C - 3 8 . 3 . 3 探针杂交验证 探针杂交是特定序列已标记的单链 D N A( 探针) 与另一个固定了的具有互补序列的D N A形成碱基配对， 通过放射性自显影或化学发光方法， 检测特定D N A序列的存在， 试验操作如下:8 . 3 . 3 . 1 探针标记: 用切口平移化学荧光素标记和检测试剂盒制备碱性磷酸醉标记探针， 荧光标记D N A探针( H - 3 5 S - a l ) 序列为5 - F l - G G G T C T T G C G A A G G A T A G T G - 3 ,8 . 3 . 3 . 2 D N A片段转移: 用毛细管法或真空转移法将D N A从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。8 . 3 . 3 . 3 探针杂交: 用 2 X S S C润湿固定D N A的膜， 加预杂交液 2 0 m L / 1 0 0 c m， 在杂交温度 5 0 C 下1 h ， 以2 . 5 m L / 1 0 0 c m膜杂交液代替预杂交液5 0 下4 h ， 去除杂交液， 用 0 . 2 X S S C / 0 . 1 0 o S D S洗两次， 每次5 m i n ， 然后在 5 0 下用0 . 2 X S S C / 0 . 1 % S D S 洗2 0 m i n ,8 . 3 . 3 . 4 D N A探针的检测: 用S a r a n 保鲜膜将