Kernel呋喃它酮代谢物说明书(2014-1-7).doc

广州市瑞品生物技术有限公司Kernel呋喃它酮代谢物酶联免疫反应试剂盒说明书 (货号：EVAMOZ-01) 1概述Kernel 呋喃它酮代谢物酶联免疫反应测试盒是用于检测饲料、鱼、虾、肉类组织（牛肉、鸡肉和猪肉）、鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿液中呋喃它酮代谢物的残留量。该试剂盒特点包括： 快速(4小时)，高回收率(80-95%)，多种样品的低成本提取方法。 高灵敏度（0.025ng/g或者0.025ppb），低检测下限（0.05ng/g）。 检测过程只需要不到1小时。 高重复性。2试剂盒原理Kernel 呋喃它酮代谢物酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，含有呋喃它酮代谢物的药物抗原已经包被于微孔板上，在分析时，样品中药物特异性地与抗体相结合。如果药品中有药物存在，它将阻止包被于微孔板上的药物与抗体结合。当与样品药物相结合的药物抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，与经酶标记物相结合。反应后颜色深度与样品中呋喃它酮代谢物的含量成反比。3.试剂盒组成部分和储存内容物规格保存呋喃它酮代谢物包被板96孔板（128 孔）2-8呋喃它酮代谢物标准品：0ng/ml阴性质控0.025ng/mL0.1ng/mL0.4ng/mL0.8mL0.8mL0.8mL0.8mL0.8mL2-81.6ng/mL6.4ng/mL0.8mL回收用10ng/ml0.8mL2-81HRP酶结合物6 mL2-810浓缩洗液(Wash Solution)50mL2-8终止液(Stop Buffer)12mL2-8TMB底物(TMB Substrate)12mL2-810样品提取液 (Extraction Buffer) 50ml2-85mM 2-硝基苯甲醛(2-Nitrobenzaldehyde)12ml2-84.样品检测下限样品检测下限虾/鱼/肉0.05饲料0.1鸡蛋/蛋粉0.05蜂蜜0.05牛奶0.05血清0.05尿液0.055.交叉反应硝基呋喃类交叉反应 (%)呋喃它酮AMOZ100呋喃唑酮AOZ0.04呋喃妥因AHD0.06呋喃西林SEM0.056未提供的设备或材料1) 酶标仪(450nm)2) 匀质器3) 漩涡振荡器4) 微量加样器(10、20、100和1000mL各一支)5) 多道枪：50-300mL6) 乙酸乙酯 7) 正己烷(或正庚烷)8) 1M NaOH9) 1M HCL7.注意事项实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。1) 标准品中含有呋喃它酮代谢物，请小心使用。2) 不要使用过期的试剂盒。3) 不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。确保酶结合物及酶结合物稀释液正确配制。4) 尽量保持室温（22.52.5）C，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。5) 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。6) 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。7) 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。8) 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。9) 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。8样品的制备样品保存在2-4不超过1-2天，如果需要保存较长的时间，应该放置-20。样品使用前应恢复到室温。1样品缓冲液按1：9的比例配制10浓缩样品缓冲液和双蒸馏水，举例：取1ml的10浓缩样品缓冲液加入到9ml双蒸馏水中，配制成10ml的1样品缓冲液，按需要，可同比例放大或缩小。1M盐酸溶液举例：取8.3ml的36%盐酸溶液定容到100ml的双蒸馏水中。按需要，可同比例放大或缩小。1M氢氧化钠溶液举例：称取4g的氢氧化钠粉末溶解到100ml的双蒸馏水中。按需要，可同比例放大或缩小。鱼/虾/肉（牛肉/鸡肉/猪肉）衍生反应（1） 称取1g匀质样品，加入4mL蒸馏水，0.5mL 1M HCl和200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡1分钟；（2） 37C恒温培养16小时，静置过夜，或者60C恒温培养3小时。 提取步骤（1） 加入5mL的1缓冲液，0.4ml的1M的 NaOH，6ml乙酸乙酯，涡旋振荡1分钟；（2） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（3） 取3mL上清液(相当于0.5g的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次4000g离心5分钟，取上层有机相），于50C减压蒸馏或50C水浴氮气吹干；（4） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5） 加入1mL的1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡1分钟；（6） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（7） 去除上层正己烷，取100 L下清液，进行样品测试。稀释倍数：2.02.2 蜂蜜衍生反应（1） 称取1g蜂蜜样品，加入4mL蒸馏水，0.5mL 1M HCl和200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡1分钟；（2） 37C恒温培养16小时，静置过夜，或者60C恒温培养3小时。提取步骤（1） 加入5mL的1缓冲液，0.4mL的1M的 NaOH，6ml乙酸乙酯，涡旋振荡1分钟；（2） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（3） 取3mL上清液(相当于0.5g的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次4000g离心5分钟，取上层有机相），于50C减压蒸馏或50C水浴氮气吹干；（4） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5） 加入1mL的1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡1分钟；（6） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（7） 去除上层正己烷，取100 L下清液，进行样品测试。稀释倍数：2.02.3 饲料I 衍生化步骤（1） 称取0.5g均质饲料，加入4mL蒸馏水，0.5mL的1M盐酸溶液，200uL衍生化试剂，涡旋振荡约1分钟左右。（2） 于37 恒温箱静置培养16小时，或者60C C恒温培养3小时。II 提取步骤（1） 加入5mL的1缓冲液，0.4mL的1M氢氧化钠溶液，6mL乙酸乙酯，涡旋振荡混匀。（2） 室温下用离心机以离心力4000g离心10分钟。（3） 移取3mL上清液到干净离心管中，于50 水浴氮气吹干，或者50 旋转蒸发仪蒸干样品。（4） 加入1mL正己烷来溶解干燥样品。（5） 加入1mL的1洗液/提取液，涡旋振荡1分钟左右。（6） 室温下用离心机以离心力4000g离心10分钟（如不分层，则振荡后于沸水中加热3分钟左右再进行离心）。（7） 取下清液100uL进行分析。稀释倍数：4.02.4 鸡蛋/蛋粉衍生反应（1） 称取1g匀质鸡蛋样品，加入4mL蒸馏水，0.5mL 1M HCl和200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡1分钟；（2） 37C恒温培养16小时，静置过夜，或者60C恒温培养3小时。提取步骤（1） 加入5mL的1缓冲液，0.4mL的1M的 NaOH，6ml乙酸乙酯，涡旋振荡1分钟；（2） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（3） 取3mL上清液(相当于0.5g的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次4000g离心5分钟，取上层有机相），于50C减压蒸馏或50C水浴氮气吹干；（4） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5） 加入1mL的1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡1分钟；（6） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（7） 去除上层正己烷，取100 L下清液，进行样品测试。稀释倍数：2.02.5 牛奶对于含脂牛奶，取3mL牛奶样品，室温（22.52.5）C下离心力4000g离心5分钟，去除上层脂肪层。衍生反应（1） 取1mL牛奶样品，加入4mL蒸馏水，0.5mL 1M HCl和200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡1分钟；（2） 37C恒温培养16小时，静置过夜，或者60C恒温培养3小时。提取步骤（1） 加入5mL的1缓冲液，0.4mL的1M的 NaOH，6ml乙酸乙酯，涡旋振荡1分钟；（2） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（3） 取3mL上清液(相当于0.5g的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次4000g离心5分钟，取上层有机相），于50C减压蒸馏或50C水浴氮气吹干；（4） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5） 加入1mL的1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡1分钟；（6） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（7） 去除上层正己烷，取100 L下清液，进行样品测试。稀释倍数：2.02.6 血清衍生反应（1） 称取1g血清样品，加入4mL蒸馏水，0.5mL 1M HCl和200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡1分钟；（2） 37C恒温培养16小时，静置过夜，或者60C恒温培养3小时。提取步骤（1） 加入5mL的1缓冲液，0.4ml的1M的 NaOH，6ml乙酸乙酯，涡旋振荡1分钟；（2） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（3） 取3mL上清液(相当于0.5g的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次4000g离心5分钟，取上层有机相），于50C减压蒸馏或50C水浴氮气吹干；（4） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5） 加入1mL的1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡1分钟；（6） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（7） 去除上层正己烷，取100 L下清液，进行样品测试。稀释倍数：2.02.7 尿液衍生反应（1） 取3mL尿液样品，室温（22.52.5）C下离心力4000g离心5分钟。（2） 取1mL尿液上清液，加入4mL蒸馏水，0.5mL 1M HCl和200 L 衍生化试剂 2-硝基苯甲醛，剧烈振荡1分钟；（3） 37C恒温培养16小时，静置过夜，或者60C恒温培养3小时。提取步骤（1） 加入5mL的1缓冲液，0.4ml的1M的 NaOH，6ml乙酸乙酯，涡旋振荡1分钟；（2） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（3） 取3mL上清液(相当于0.5g的原始样品) 到另一试管（避免触及下层水相！如果移取液中含有水相，再次4000g离心5分钟，取上层有机相），于50C减压蒸馏或50C水浴氮气吹干；（4） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥物；（5） 加入1mL的1样品提取液 / 洗液，最大速度涡旋振荡1分钟；（6） 室温（22.52.5）C下离心力4000g离心10分钟；（7） 去除上层正己烷，取100 L下清液，进行样品测试。稀释倍数：2.09检测步骤试剂准备注意：试剂在使用之前要在室温下解冻1-2小时，确定在使用前阅读过注意事项。准备适量的检测用试剂，所有的试剂摇匀后使用。准备足够所有小管所需的用量，不能将试剂倒回原来的瓶子中，处理试剂时建议用废弃的瓶子以降低污染的风险。1工作洗液/提取液按1： 9的比例配制10浓缩洗液/提取液和双蒸馏水，举例：取10ml的10浓缩洗液/提取液加入到90ml双蒸馏水中，配制成100ml的1工作洗液/提取液，按需要，可同比例放大或缩小。检测：以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。试剂每个反应需要的体积24次反应的体积HRP酶标抗原50 mL1.2mL工作洗液1 mL24mL终止液100 mL2.4 mL底物100 mL2.4 mL（1） 加入100mL的标准品或样品于所设定的孔中；（2） 在每孔中加入50mL的AMOZ-HRP酶标抗原， 轻敲微孔板混匀60秒；（3） 室温（22.52.5）C避光孵育30分钟；（4） 洗板3次，每次应该加入250mL 1洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；（5） 每孔加入100mL的TMB底物；在室温（22.52.5）C下避光培养2