5--实验室质量保障

药品微生物检验实验室保障药品微生物检验实验室保障 药品微生物检验实验室需要解决哪些问题？药品微生物检验实验室需要解决哪些问题？ 是否有污染？是否有污染？ 何种菌污染？何种菌污染？ 从那儿被污染？从那儿被污染？ 怎样保证一次性报告？怎样保证一次性报告？怎样保证检验质量？怎样保证检验质量？ 药品微生物检验实验室质量保障药品微生物检验实验室质量保障 怎样保证检验质量？怎样保证检验质量？ QbD（quality by design） 实验人员实验人员培养基培养基 实验器材实验器材 实验环境实验环境 检验结果检验结果待检样品待检样品 原料原料辅料辅料 设备设备 环境环境 药品药品（食品食品）人员人员 药品食品生产过 程中可能污染微 生物的主要环节 药品食品微生物检 查过程中可能污染 微生物的主要环节 药品微生物检验特点药品微生物检验特点 药品因素 环境影响 培养观察 抽样检查 破坏试验 方法验证 过程控制 微生物检验的过程控制微生物检验的过程控制 环境保证环境保证培养基保证培养基保证 无菌性检查无菌性检查 灵敏度检查灵敏度检查 有效的方法有效的方法方法验证方法验证SOP操作操作 有效的结果有效的结果 可靠的结论可靠的结论 结果判断结果判断 药品微生物检验实验室质量保药品微生物检验实验室质量保 1、实验设施实验设施（硬件硬件物质保障物质保障） 2、检验程序检验程序（软件软件有效的结果有效的结果） 3、结果判断结果判断（调查调查可靠的结论可靠的结论） 1 1、实验设施、实验设施 （1）实验室系统 （2）操作环境 （3）关键设备 （4）培养基 物 质 保 障 （1）、实验室系统 洁净实验条件洁净实验条件 有效性：有效性：整体10000级、局部100级。 安全性：安全性：保护样品、人员和环境。 可操作性：可操作性：方便、快捷、顺畅。 洁净实验条件的维护、验证洁净实验条件的维护、验证 阳性菌实验室达到阳性菌实验室达到P2P2生物安全标准生物安全标准 （1）、实验室系统中检所微生物实验室 （1）、实验室系统 实验室系统的管理与维护： 1）、屏障系统的有效性 压差、风速、微粒、照度 （外包服务合同） 2）、清洁、静态与动态监控、熏蒸 3）、环境菌库 环境菌库 新洁尔灭分离微生物 酒精棉球分离微生物 环境菌库 洁净环境常见菌（浮游菌）： 头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus） （2）、操作环境 1）、隔离器 2）、生物安全柜 3）、超净工作台 （2）、操作环境 分类样品安全人员安全环境要求点评 隔离器？ 验证困难，灭菌不彻底：假阳性 灭菌剂残留：假阴性 生物安全柜？ 动态验证困难，不适合多任务的 检验活动 超净工作台 经典、廉价、适合多任务的检验 活动。提高实验室新风供给、加 强实验室监控可以扬长避短 （3）、关键设备 微生物检查薄膜过滤仪 一次性薄膜过滤培养器 （4）、培养基 培养基适用性（灵敏度）； 培养基性能稳定性（标准化）。 对照培养基 理化评价（可控性） 生物学评价（有效性）回收率比较 MPN比较 生长曲线比较 生态评价 某些CRS原则 固态培养基 液态培养基 琼脂加减法 2、检验程序、检验程序 环境保证环境保证培养基保证培养基保证 无菌性检查无菌性检查 灵敏度检查灵敏度检查 有效的方法有效的方法方法验证方法验证SOP操作操作 有效的结果有效的结果 可靠的结论可靠的结论 结果判断结果判断 2、检验程序、检验程序 接受任务 实验方案 实验准备 样品核对 实验操作 过程监控 培养观察 有效的结果 物 质 保 障 实验室管理规范（软件）实验室管理规范（软件） 编写说明及批准页 1 实验室概况 1.1 实验室简介 1.2 实验室通讯资料 1.3 实验室认可项目/参数表 1.4 实验室平面图及功能区域 1.5 仪器设备总览 1.6 常备试剂耗材一览表 1.7 实验室发展目标 2 管理规范 2.1 安全管理 2.2 业务流程 2.3 人员管理（6个SOP） 2.4 样品管理（3个SOP） 3 标准操作规程 3.1 检验工作SOP（13个） 3.2 仪器操作SOP（30个） 3.3 实验记录SOP（9个） 4 实验室保障 4.1 实验室设施、设备及消耗品供应商确定原则 4.2 实验室设施服务商 4.3 实验设备供应商 4.4 实验室消耗品供应商 （1）、实验准备 实验准备应坚持“平战结合”，物质准备有备 无患，应随时保证“来之能战” 。 尤其注意常备有效期要求的物品：培养基、冲 洗液、滤器、小型实验器材等。 （2）、样品核对 尽快取得样品，确保样品传递过程中的完 整性、安全性、有效性； 仔细核对样品及样品资料，高度关注媒体 公布样品（问题样品），同时尽量获取非 问题样品及同类样品，进行比较实验、比 较分析； 样品外观检查、完整性检查。 （3）、实验操作 不断完善标准化操作规程（SOP），严格避免实 验室污染。 实验人员实验人员培养基培养基 实验器材实验器材 实验环境实验环境 检验结果检验结果待检样品待检样品 原料原料辅料辅料 设备设备 环境环境 药品药品（食品食品）人员人员 药品食品生产过 程中可能污染微 生物的主要环节 药品食品微生物检 查过程中可能污染 微生物的主要环节 硫乙硫乙 阴性阴性 090423090423 马丁马丁 阴性阴性 090423090423 马丁马丁 样品样品 090423090423 硫乙硫乙 样品样品 090423090423 马丁马丁 阳性阳性 090423090423 硫乙硫乙 阳性阳性 090423090423 监控平板监控平板 样品样品沉降菌沉降菌手指手指 无菌检验框架示意图无菌检验框架示意图 3、结果判断、结果判断 长菌与否 分离鉴定 溯源调查 结果报告 可靠的结论 有效的结果 物 质 保 障 3、结果判断、结果判断 是不是微生物？ 是什么微生物？ 微生物来自哪里？ 几点思考 参见：FTIR法用于药品检出菌与药品微生物检验洁净室环境菌的 相似性考察药学学报，2007，42（11）：11891194 判断无菌检查阳性结果有效性的实验探讨药物分析杂 志，2008， 28（05）：6671 （1）、长菌与否？ 1）、液体培养基浑浊 物理变化？化学变化？生物学变化？ 2）、平板上的菌落 琼脂表面、琼脂中、琼脂和平皿夹层 菌落or药渣？ 经经60 60Co Co射线大剂量照射再检验射线大剂量照射再检验 延长培养时间到延长培养时间到7 7天天 重新划线培养重新划线培养 镜检镜检 （2）、分离鉴定 1）立即转接2ml该培养物至相同的培养基中继 续培养； 2）取5支冻存管，每管分装1ml浑浊培养物，- 80保存； 3）取浑浊培养物在TSA平板/血琼脂上划线，分 离污染微生物； 4）如果发现硫乙醇酸盐流体培养管变浑浊，还 应增加血平板划线，并在厌氧条件下培养分离 厌氧菌。由平板分离到的菌落应进一步鉴定， 并逐一保藏。 是什么微生物？ 宏观：生长形态 微观：镜检 鉴定：生化鉴定（API、BD） 核酸鉴定（16sRNA、DNA） 20092009年年1212月能力验证中各所的技术能力月能力验证中各所的技术能力 单位单位形态分析形态分析生化鉴定生化鉴定相似性分析相似性分析分子生物学技术分子生物学技术 上海所上海所显微数码成像显微数码成像APIAPI实验条、实验条、梅里埃梅里埃VITEK2VITEK2Bruker Tensor27Bruker Tensor2716sRNA16sRNA、杜邦、杜邦RiboprinterRiboprinter 天津所天津所显微数码成像显微数码成像APIAPI实验条、实验条、梅里埃梅里埃VITEK2VITEK2Bruker Tensor27Bruker Tensor27杜邦杜邦RiboprinterRiboprinter（外包）（外包） 浙江所浙江所显微数码成像显微数码成像梅里埃梅里埃VITEK2VITEK2Bruker Tensor27Bruker Tensor27分子生物学分子生物学（外包）（外包） 江苏所江苏所显微数码成像显微数码成像梅里埃梅里埃VITEK2VITEK2杜邦杜邦RiboprinterRiboprinter， MicroseqIDMicroseqID 广州所广州所显微数码成像显微数码成像APIAPI实验条、实验条、梅里埃梅里埃VITEK2VITEK2杜邦杜邦RiboprinterRiboprinter（外包）（外包） 黑龙江黑龙江显微数码成像显微数码成像梅里埃梅里埃VITEK2VITEK2（外包）（外包）Bruker Tensor27Bruker Tensor27 北京所北京所显微数码成像显微数码成像APIAPI实验条实验条Bruker Tensor27Bruker Tensor27 总后所总后所显微数码成像显微数码成像APIAPI实验条实验条Bruker Tensor27Bruker Tensor27 四川所四川所显微数码成像显微数码成像APIAPI实验条实验条 梅里埃梅里埃VITEK2VITEK2（外包）（外包） 山东所山东所显微数码成像显微数码成像APIAPI实验条实验条ThermoThermo近红外近红外 （3）、溯源调查 样品阳性培养物分离菌株 检验过程监控菌株 环境菌（近期、远期） 现场调查收集菌株 鉴定与相似性分析相结合 传统方法与新技术相结合 不同方法的交叉验证 微生物来自哪里？ 相似性分析 同源性分析 脉冲场电泳（PFGE）、傅立叶红外（FTIR） Absorption wavenumbers cm-1 FT-IR Spektrum of microorganisms CH-Stretch (lipids) amid I (proteins) amid II C-O- Stretch (carbohydrates) 傅立叶红外（FTIR） 标 示谱段(cm-1) 振动类型代表的细胞组分 3000-2800 CH伸缩振动区细胞膜脂肪酸 1800-1500 酰氨（、）区细胞蛋白和肽类，DNA、RNA结构 1500-1200 混合区蛋白质和脂肪酸，磷酯 1500-1400 二级脂肪酸区两性细胞质膜成分（蛋白质和类脂） 1200-900 C-O伸缩振动区伸缩振动区细胞壁多聚糖细胞壁多聚糖 900-700 指纹区长链脂肪酸 微生物IR图谱测定基本步骤 固体培养基 划线培养 取样并在水中制 成均匀混悬液 点样真空减压 干燥制成菌膜 液体培养基 培养 离心、盐水洗、 水洗 扫 描 图 谱 培养 制样 Sample Preparation Automated measurement after drying of the samples! 2. Suspending 1. Harvesting3. Loading HTS-XT 不同来源的阴沟肠杆菌的不同来源的阴沟肠杆菌的FT-IR一阶导数光谱（一阶导数光谱（1180-900cm-1）的比较）的比较 蓝色蓝色来自实验室无菌阳性样品中的分离菌来自实验室无菌阳性样品中的分离菌 绿色绿色其它来源的无菌阳性样品中的分离菌其它来源的无菌阳性样品中的分离菌 中检所判断药品污染的方案中检所判断药品污染的方案 定期采集定期采集 环境菌环境菌 FTIR图谱图谱 测定测定 外环境菌谱库外环境菌谱库 内环境菌谱库内环境菌谱库 药品微生药品微生 物检测物检测 FTIR图谱图谱 测定测定 相似相似 不相似不相似 药药 品品 污污 染染 实验实验 环境环境 污染污染 相似相似 不相似不相似 操操 作作 失失 误误 进一步比较进一步比较 重试重试 药品微生物实验药品微生物实验 环境微生物环境微生物 的监测的监测 药品的微生药品的微生 物检测物检测 环境细菌与药品环境细菌与药品 细菌的比较细菌的比较 结论结论 保证药品微生物检验结果可靠的有效途径保证药品微生物检验结果可靠的有效途径 图图 不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系不同来源的阴沟肠杆菌红外图谱聚类关系 结果判断结果判断- -欣弗事件欣弗事件 编号鉴定结果 0206L1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）； 2、粘质沙雷菌（S.marcescens） 0206G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）； 2、粘质沙雷菌（S.marcescens） 298L； 298G 1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）； 2、粘质沙雷菌（S.marcescens） 303L； 303G 1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）； 2、阴沟肠杆菌（Enter. cloacae） 305L； 305G 1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）； 2、粘质沙雷菌（S.marcescens） 306L/6G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ） 307G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ） 308L（Al.faecalis） 309L（Al.faecalis） 304G嗜麦芽寡养单胞菌（S.maltophilia） 欣弗培养物欣弗培养物 洁净环境常见菌：洁净环境常见菌： 头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus） 山羊葡萄球菌（Staphylococcus caprae） 肺炎克雷伯肺炎克雷伯巨大芽孢杆菌巨大芽孢杆菌粘质沙雷菌粘质沙雷菌 夺命的欣弗夺命的欣弗 结果判断结果判断- -刺五加事件刺五加事件 云南样品云南样品BD鉴定菌株鉴定菌株 1016-9196-D-L-1Enterobacter cloacae 1016-9196-D-L-3Enterobacter cloacae 1016-9196-D-L-4Enterobacter cloacae 1016-9196-1Enterobacter cloacae 1016-9196-2Enterobacter cloacae 1016-9196-3Enterobacter cloacae 1016-9196-4Enterobacter cloacae 1016-TSA-9196-D-L-1Enterobacter cloacae 1016-TSA-9196-D-L-2Enterobacter cloacae 1016-TSA-EDM-1Enterobacter cloacae 1016-TSA-EDM-2Enterobacter cloacae 9196-dEnterobacter cloacae 培养物革兰氏染色培养物革兰氏染色培养物革兰氏染色培养物革兰氏染色直接涂片革兰氏染色直接涂片革兰氏染色 问题刺五加问题刺五加 完达山样品完达山样品BD鉴定菌株鉴定菌株 H3-SSI-1Enterobacter cloacae H3-TSA-4-1Enterobacter cloacae H6-TSA-3-1Enterobacter cloacae H3-SSI-2Enterobacter cloacae H3-TSA-4-2Enterobacter cloacae H6-TSA-3-2Enterobacter cloacae 脉冲场电泳分析脉冲场电泳分析 结果判断示例结果判断示例3 3 编号BD鉴定鉴定 走廊1B.pumilus 走廊2M.luteus 走廊3/ 无菌室4C.urealyticum 无菌室5K.kristinae 无菌室6C.urealyticum C1524-FS.caprae C1524-BS.caprae C1525-B1-1S.warneri C1525-B1-2S.epidermidis C1525-B2S.warneri C1525-F1S.warneri C1525-F2-1S.capitis C1525-F2-2S.epidermidis C1526-B1C.urealyticum C1526-B2S.warneri C1526-F1S.epidermidis C1526-F2S.haemolyticus 菌株16sRNA鉴定鉴定可信度 C1524-FS. haemolyticus99% C1524-BS. haemolyticus98% C1526-F2S. haemolyticus100% 双黄连注射液双黄连注射液利巴韦林注射液利巴韦林注射液 FTIRFTIR相似性分析相似性分析 DuPont RiboPrinterDuPont RiboPrinter基因指纹分析基因指纹分析 几点思