谈分子生物技术在中药鉴定中的应用

1 / 5 谈分子生物技术在中药鉴定中的应用 摘要： 分子生物技术与植物学、动物学研究的结合，使中药品种研究进入了一个新的高度。中药材（不含矿物药）所依赖的生物资源的多样性是基于其基因的多态性结果，而基因多态性可在分子水平上检测，它是比在形态、组织、化学水平上的检测更能代表其变异类型的遗传标记。 关键词： 分子生物技术；基因技术；中药鉴定 近年来分子生物技术与植物学、动物学研究的结合，使中药品种研究进入了一个新的高度。中药材（不含矿物药）所依赖的生物资源的多样性是基于其基因的多态性结果，而基因多态性可在 分子水平上检测，它是比在形态、组织、化学水平上的检测更能代表其变异类型的遗传标记。目前，用于中药鉴别的分子生物学方法主要有：随机扩增多态性 DNA、DNA 直接测序法、限制性片断长度多态性分析技术、多聚酶链反应测序技术、生物芯片技术、 DNA 指纹技术等。 1 基因技术 1.1 DNA 分子遗传标记技术 1 这是一种根据不同生物个体遗传物质 DNA 的差异来鉴别生物物种的方法。生物的外观性状、细胞形态、组织结构、2 / 5 化学成分、蛋白质等不仅受遗传因素的影响，还与生物的生长环境、发育阶段、生理状态有关。而 DNA 作为遗传信息的直接载体，不受上述因素的影响，因此 DNA 分子遗传标记鉴别药材的方法具有高度的准确性与可靠性。（ 1）限制性片段多态性（ RFLP） 是依据不同植物个体来源的 DNA 所形成的不同的谱带模型与低拷贝的 DNA 探针杂交得到 DNA 的限制性片段多态性，它代表的是基因组 DNA 在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。（ 2）随机扩增多态性 DNA（ RAPD）原理是根据 DNA 聚合酶链反应技术（ PCR），采用人工合成的随机引物，以植物组织分离的基因组 DNA 为模板，进行多态性 DNA 片段的随机合成反应，从而根据 DNA 片段，将植物不同基因组予以区别。（ 3）扩增片段长度多态性（ AFLP）是 RFLP和 RAPD 两种技术相结合的一种分子标记技术，既有 RFLP 的专一性、可靠性，又有 RAPD 技术的随机性、方便性。如：用 AFLP 技术构建人参和西洋参的指纹图谱，具有丰富的多态性，对鉴别真假人参、人参品种提供了非常有效的工具。用 AFLP 技术对石斛属植物进行了鉴定，具有快捷、准确、可信度高的特点。（ 4） DNA 测序法以 PCR 扩增产物作为测序引物，提高了 DNA 序列分析的效率。直接对某基因片段 PCR扩增产物测序，找出其种属特异性来鉴别中药其中常用 的基因片段包括线粒体细胞色素和 rRNA 基因等。如龟甲的鉴定 2。 3 / 5 1.2 mRNA 差异显示技术 该法旨在找出不同组织或细胞在基因表达上的差异，是通过将 RNA 反转录成单链 cDNA，然后 PCR 扩增，最后分离不同分子大小的 DNA，挑选出有差异表达的基因进行序列分析，这样既可以制备探针用于稳定灵敏的检测实验，亦可制备其蛋白产物及其抗体进行免疫检测 3。借助该技术可以将种植与野生的植物药、道地药材与普通药材之间的差异鉴别出来。 2 DNA 序列标记技术 基于 PCR 的 DNA 直接测序技术是以 PCR 扩增 产物作为测序引物，极大地提高了 DNA 序列分析的效率。目前用于 DNA 测序的基因，主要有植物类叶绿体基因组的 rbcL， mat Ky 与核基因组的 rRNA， ITS 等，动物类线粒体基因组的 cyt b 13。利用特异性引物对当归、大黄种子中 rRNA 基因内转录间隔区进行套式 PCR 扩增，并将其碱基序列测定，结果显示当归、大黄种子 rRNA 基因内转录间隔区的碱基序列具有明显的差异和可对比性，不同植物中药材种子 rRNA 基因内转录间隔区碱基序列可作为从分子水平进行鉴定的标记。如测定分析了 8 种 24 个麻黄样品的 ITS 序列， 8 个种被分成 3个群体，分类结果与地理关系相一致，显示出了地理差异性，同时依此结果设计了一套引物用于不同产地麻黄的鉴别4 / 5 3。但常规 PCR 所需的引物对必须是在已知靶 DNA 序列的前提下才能设计、合成，这大大限制了未知序列的基因组 DNA扩增的应用范围。 3 生物芯片技术 基因芯片技术是指采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的 DNA 探针固定于支持物表面上，产生二维 DNA 探针阵列，然后与标记样本杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行、高效检测或医学检测。基因芯片鉴别中药材这一技术的前提是获取不同的 中药样本的特异性基因序列，即基因分型。研究者找出某种中药品种的特定基因或DNA 序列后，将这些特定序列作为探针固定于玻片上制成基因芯。当一个来自植物或动物的中药样本中含有与之互补的特定基因片段时，基因芯片可将其测试出来，由单片芯片就可用于多种中药样品鉴别 4。生物芯片在中药研究中的应用，目前还处在摸索阶段，其理论与方法还不成熟。随着生物芯片技术研发的进行，生物芯片技术在药物研究与开发领域的应用也将更广泛更深入。 总之，利用分子生物技术鉴别中药的方法与传统的中药鉴别方法相比具有准确性高、重现性好、真实、稳定 、可靠的优点。分子生物技术在中药鉴定实践中的不断应用和日臻完善，利用现代化分析技术鉴别中药的真伪，创建更为先进的中药质量评价体系，发展现代中药质量控制技术，已经成为5 / 5 保证中药安全、有效、可控，实现中药现代化的关键。 【参考文献】 1方和桂 .基因技术在中药鉴定中的应用 J .中草药， XX， 37（ 2）： 315. 2 Study on PCR identification of the Chinese crude dr Oviductus Ranae J .Appl Environm Biol， 2000，6（ 2）： 166 167. 3 Shi M M.Enabling large scale pharmacogenetics studies by high throughput mutation detection and genotyping technologies J .Chinchem Lett， 2001， 47（ 2）： 164. 4 Cai Z H， Li P， Dong