谈基因定位技术在遗传病诊断中的应用

1 / 6 谈基因定位技术在遗传病诊断中的应用 摘要： 荧光 PCR 定量技术 (Quantitative PCR)是一种新兴的基因定位技术。这项技术灵敏、简便、快速、不需使用放射性同位素， PCR 完成后，通过测序仪的自动识别即可对待测 DNA 进行定量分析。在遗传病，特别是一些以大片段缺失为主要突变类型的遗传病诊断中，荧光 PCR 定量技术发挥了很重要的作用。 关键词：荧光 PCR 定量技术；基因定位技术；遗传病 在早期的遗传学分子诊断中，主要依赖于 Southern Blotting，寡核苷酸杂交 等技术。自 1985 年 Saiki 等首次描述聚合酶链反应 (polymerase chain reaction， PCR)以来，PCR 技术因为其灵敏特异，省时省力等诸多优点而受到了人们的高度重视，已经应用于生物医学和化学等基础研究的各个领域，并且成为医学临床和法医学研究的强有力分析工具之一 1-3。然而，近几年来，研究者们不再满足于得知某一特异 DNA 序列的存在与否，他们更着眼于对其进行精确的核酸定量。尽管把 PCR 作为一种定量的工具，在技术上还面临着一些挑战。荧光 PCR 基因定位技术是近十余年来兴起的一种分子生物学技 术，与其他定量方法相比，具有灵敏、简便、快速、不需使用放射性同 2 / 6 位素的特点，在基因表达、传染病和遗传病的诊断等方面迅速得到了广泛应用。 1 荧光 PCR 基因定位技术的原理 荧光 PCR 定量技术的主要原理为：在 PCR 前，通过化学方法在引物的 5 端通过共价方式连接一个荧光分子。由于在进行 PCR 时，引物和待扩增模板 5 端的碱基不需要完全匹配，荧光 PCR 引物和普通 PCR 引物一样，能够对待测模板进行指数扩增。扩增完成后，根据 PCR 的产量，将荧光 PCR产物直接或按一定比例稀释后， 和内标、载样缓冲液混合，在自动测序仪上进行电泳。在自动测序仪内激光的激发下，PCR 产物上的荧光分子发出固定波长的激发光，被仪器内的光电管捕获。根据 PCR产物从开始电泳到经过光电管的时间，测序仪自动计算出相应产物的实际碱基数。不同泳道之间电泳速度的差别，通过各产物内混合的内标校正。同时，测序仪也自动标出相应产物的荧光强度，该数值就是荧光 PCR 定量技术对模板进行定量与定位的基础。与非定量 PCR 分析方法不同，荧光 PCR 的操作程序有助于评估污染的情况，即测出污染的程度，即使阴性对照产生了正的信号，只要这些信号比实验 样品的低得多，依据这样的结果，至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的 4-6。在一定程度上，荧光3 / 6 PCR 消除了普通 PCR 过于敏感、假阳性率高的缺点。荧光 PCR常用于研究发病机制、估计病毒的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量的检测，将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来，为疾病的诊断和药物治疗监测提供科学的依据。目前，该技术已广泛应用于多种遗传病的诊断和产前筛查，如地中海贫血、儿童型脊肌萎缩症、杜氏 /贝氏肌营养不良、胖骨肌萎缩症和各种染色体病等。 2 荧光 PCR 基因定位技术在遗传病诊断中的应用 2.1 在 地中海贫血中的诊断作用 1988 年， Chehab 用两对引物同时扩增 珠蛋白和 珠蛋白基因，并在这两对引物上分别标记上罗丹明和荧光素。在紫外线的照射下，罗丹明产生红色荧光而荧光素产生绿色荧光。在同一循环条件下 PCR 完成后，通过离心将扩增产物和游离引物分离，根据扩增后产物颜色直接判断基因的缺失情况 7。如产物为桔红色，则说明 和 珠蛋白基因都得了扩增。如果产物为绿色，说明 珠蛋白基因缺失，只有显绿色荧光的 珠蛋白基因得到了扩 增。 2.2 在 DMD/BMD 中的应用 4 / 6 DMD/BMD(杜氏 /贝氏肌营养不良症 )是最常见的致死性神经肌肉遗传病。在男性中，其患病率约为 1/3 500，为x 连锁隐性遗传，其中 73%为缺失或重复突变，新生突变占所有患者的 30%。由于 x 染色体的随机失活比例不同，约 40%的 DMD 携带者不能通过血清 CPKH 活性诊断。 1992 年，schwartz 将荧光 PCR 应用于该病的携带者诊断。他们采用荧光引物和测序仪分析位于肌营养不良基因内部的 4 对 CA 重复序列。测序仪可以鉴别 2 个碱基对长度的差异，能够为连锁分析提供更多的信息 8。在以下情况时，连锁分析有时不足以对携带者进行判断： CA 重复不能提供信息， 家族成员不全， 新生突变或者嵌合体造成的连锁分析失效，因此，他们还采用荧光 PCR 直接扩增肌营养不良基因外显子，并用测序仪定量分析产物，将结果和连锁分析一起作为判断携带者的依据。通过以上方法，他们对 43 名可疑携带者进行了诊断。 2.3 在 PGD 的应用 植入前诊断 (PGD)只能获得非常有限的模版，而荧光PCR 比溴乙锭染色要敏感 1 000 倍，因此，荧光 PCR 在植入前诊断中 的应用已经有较多的探索。等位基因失扩增 (ADO)和污染是植入前诊断所面临的两个主要问题，因此 PGD 需要检测致病基因和连锁分析进行联合判断。但是限于取材， PGD只能提供一次 PCR 的模版。荧光 PCR 由于高灵敏度和分辨率，5 / 6 适合对少量模版进行多重 PCR 扩增，在一个体系中同时完成对疾病基因的检测和连锁分析。 Joycec 采用荧光多重 PCR 对6 种遗传病：强直性肌营养不良 (DM)、囊性纤维 (CF)、脆性X 综合征、神经纤维化 2 型和颅面成骨不全症进行了植入前诊断。在进行 PCR 的过程中都同时扩增了一个多态位点，以确定被扩增细胞的 来源以及排除污染 9。对于显性遗传病，多态位点还能够减少 ADO 可能带来的误诊。在他们进行的研究中，对 14 次妊娠进行的植入前诊断都得到明确结论，其中 13 例进行了胚胎移植，另有 1 例没有检测到正常胚胎。 总之， PCR 技术在定量与定位领域中的应用已经逐渐由实验室中的探索发展成为理解复杂的生物本质的一项关键技术。毫无疑问，在不久的将来，荧光定量 PCR 技术将以其精确的定量，简单迅速的操作，合理的成本，在分子生物学、实验医学，特别是临床医学领域中得到更加广泛的应用。 参考文献 1J.萨姆布鲁克， D.W 拉塞尔 . 分子克隆实验指南M.3 版 . 北京：科学出版社， 2002： 488. 2彭志文，朱子平 . PCR 检测乙肝 DNA的注意事项 J.中国医药导报， XX， 3（ 24）： 147. 3鲁军 .荧光定量 PCR 检测乙肝病毒 DNA 的临床意义6 / 6 J.中国医药导报， XX， 5（ 33）： 78. 4刘炜，马俊 .FQ-PCR 检测沙眼衣原体及解脲支原体J.中国现代医生， XX， 46（ 6）： 139-140. 5罗燕春，李勇，郑惠兰，等 .荧光定量 PCR 检测 淋球菌、沙眼衣原体结果探讨 J.江西医学检验， XX， 23(6)：615-616. 6于晓芳，许晏，刘漪，等 . PCR-BHEL 技术对血清中 HCV RNA 的检测 J.临床和实验医学杂志， XX， 7（ 9）：40. 7张正分子生物学技术在检验医学中的应用 J.中华检验医学杂志， XX， 26： 735-736 8Sangier Veber P. Detection of heterozygous SMN1 deletions in SMA families using a simple fluoreseent muitiplex PCR methodJ.MedGene