【硕士论文】脂代谢紊乱对大鼠肾小管上皮细胞rOAT3基因表达.pdf

脂代谢紊乱对大鼠肾小管上皮细胞r O A T 3 基因表达的影响 摘要 目的研究高脂血症对大鼠肾小管上皮细胞r O A T 3 ( r a t o r g a n i c a n i o n r a n s p o r t e r 3 ) 基因表达的影响，探讨脂代谢紊乱与痛风及高尿酸血症的相关性。 方法以雄性O L E T F 大鼠为研究对象，以雄性L E T O 大鼠( 与O L E T F 大鼠同 系) 为对照。基础饲辎饲养至7 周龄，剪尾取血保存，1 l 周龄时所有大鼠用水 合氯醛腹腔注射麻醉，左肾静脉取血，活体取肾皮质液氮保存，采用生化仪检测 J f 【L 脂、尿酸、血糖、尿素氮、肌酐，采用逆转录一聚合酶链反应( R T P C R ) 方法 检测r O A T 3 活性和m R N A 水平。大鼠生化指标和r O A T 3 表达水平用( X S ) 表示， 组间两两比较选用t 检验。 结果( 1 ) 5 周龄O L E T F 大鼠的血糖、血尿酸、血脂水平与对照组L E T O 大 鼠相比无明显差异：( 2 ) 7 周龄O L E T F 大鼠血脂( T G 、T C ) 水平比对照组L E T O 大鼠增高但差异无显著性；( 3 ) 1 l 周龄O L E T F 大鼠的血脂水平明显高于对照组 ( P O 0 5 ) ：O L E T F 大鼠肾小管上皮细胞r O A T 3 活性和基因表达明显低于对照组 ：P O 0 5 ) ；血糖、尿素氮、肌酐、血尿酸水平与对照组L E T O 大鼠相比无明显差 耳。 结论脂代谢紊乱时O L E T F 大鼠肾小管上皮细胞r O A T 3 基因表达降低，肾 小管上皮细胞r O A T 3 基因表达减弱与尿酸排泄减少有关，脂代谢紊乱与痛风及高 尿酸血症的发病相关。 关键词：脂代谢紊乱：O L E T F 大鼠；r O A T 3 ；基因表达 T h ei n f l u e n c eo fd i s l i p i d e m i ao nr O A T 3i nr e n a lt u b u l a re p i t h e l i ao f r a t s A B S T R A C T O b j e c t i v e ：T oi n v e s t i g a t e t h ei n f l u e n c eo fh y p e r l i p i d e m i ao nr O A T 3 ( r a t o r g a n i c a n i o nt r a n s p o r t e r 3 ) i nr e n a l t u b u l a re p i t h e l i ao fr a t s T om a k ec l e a rt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nd i s l i p i d e m i aa n dt h ed e v e l o p m e n to fg o u ta n dh y p e r u r i c e m i ab y a n i m a le x p e r i m e n t s M e t h o d s ：E x p e r i m e n t a lg r o u pi n c l u d e dt e nf o u r w e e k s - o l dm a l eO L E T F r a t s ， c o n t r o lg r o u pi n c l u d e dt e nf o u r - w e e k o l dm a l eL E T Or a t sw h i c hb e l o n g e dt ot h e s a m ek i n d w i t hO I ，E T Fr a t s T h e yw e r ea l lg i v e na d a p t i v et r e a t m e n tf o rs e v e n w e e k s ，d u r i n gt h et i m et h e yw e r et a k e no u tb l o o df r o mt h et a i l se v e r yw e e k R e s e r v e t h es e r u ms e p e r a t e df r o mt h eb l o o d T r e a te l e v e n - w e e k o l dr a t sw i t hc h l o r a lh y d r a t e b yr e j e c t i o ni na b d o m i n a lc a v i t y ，t a k eb l o o df r o mt h el e f tk i d n e yv e i n ，a n dt a k eo u t s o m ek i d n e yc o r t e x T h ec o n c e n t r a t i o no fs e r u ml i p i d 、u r i ca c i da n dg l u c o s ew e r e d e t e r m i n e db yb i o c h e m i s t r ym e t h o d T h ea c t i v i t yo f r O A T 3a n dt h el e v e lo f i t sm R N A w e r ed e t e r m i n e db yR P C R T h ed i f f e r e n c eo f t h el e v e l sw a sa n a l y z e db yTt e s t R e s u l t s ：( 1 ) T h e l ew a sn os t a t i s t i cd i f f e r e n c ei nt h el e v e l so f g l u c o s e 、u r i ca c i d a n dl i p i do f f i v e w e e k o l dr a t sb e t w e e nt h et w og r o u p s ( 2 ) T h el e v e l so f T Ga n dT C i ns e v e n - w e e k o l dO L E T Fr a t sw e r eh i g h e rt h a n ，t h o s ei nc o n t r o lg r o u p ，b u tt h e r ew a s i l os t a t i s t i c ss i g n i f i c a n c e ( 3 ) T h el e v e l so ft h el i p i di ne l e v e n - w e e k o l dO L E T Fr a t s w e r eh i g h e rt h a nt h o s ei nc o n t r o lg r o u p ( P O 0 5 ) ；T h ea c t i v i t yo fr O A T 3a n di t sg e u e e x p r e s s i o nw e r es i g n i f i c a n t l y l o w e ri nr e n a lt u b u l a re p i t h e l i ao fe l e v e n - w e e k s o l d O L E T Fr a t st h a nt h o s ei nc o n t r o lg r o u p ( P O 0 5 ) ；T h e r ew a sn os t a t i s t i cd i f f e r e n c ei n t h el e v e l so fg l u c o s e ，B U N ，C ra n du r i ca c i di ne l e v e n - w e e k s o l dO L E T Fr a t sb e t w e e n t h et w og r o u p s C o n c l u s i o n ：T h eg e n e e x p r e s s i o no fr O A T 3d e c r e a s e di n r e n a lt u b u l a r e p i t h e l i ao fO L E T F r a tw i t hd i s l i p i d e m i a T h ed e c r e a s e dg e n ee x p r e s s i o no fr O A T 3 m a yc o n t r i b u t e t ot h er e d u c e m e n to fe x c r e t i o no fu r i ca c i d T h ed i s l i p i d e m i a c o n t r i b u t et ot h ed e v e l o p m e n to fg o u ta n dh y p e r u r i c e m i a K e yw o r d s ：d i s l i p i d e m i a ；O L E T Fr a t ；r O A T 3 ：g e n ee x p r e s s i o n 青岛人学硕十学位论文 脂代谢紊乱对大鼠肾小管上皮细胞r O A T 3 基因表达的影响 引言 痛风( G o u t ) 是一组由嘌呤代谢紊乱所致的疾病。原发性痛风9 0 以上是由尿 酸排泄减少所致，可能属于多基因遗传病”“。原发性高尿酸血症是痛风的最常见病 因，其发病可能与某些易感基因有关。”，国外研究发现人有机阴离子转运子h 0 A T 3 活性和基因表达降低与高尿酸血症有关”1 。 r 0 A T 3 c D N A 全长2 1 9 1 b p ，编码5 3 6 个氨基酸的蛋白质。人rO A T 3 的类似物hO A T 3 基因位于1 l q l l 7 ”1 ，O A T 3 在肾近端小管、远端小管和集合管广泛表达。近年来， 已坟分子水平证实了4 种转运蛋自质参与了尿酸砘的转运”：产电的尿酸虢单向转 运体( U A T ) “o I l l 有机阴离子转运体( O A T ) 超家族的三种转运蛋白：U R A T l ”“2 ”1 ， O A T I ”1 和0 A T 3 “”。其中h U A T 主要参与肾近曲小管对尿酸盐的分泌，h U R A T l 主要 参与肾近曲小管对尿酸盐的重吸收，重吸收的尿酸盐穿过上皮细胞基底膜进入管周 毛细循环，进入管周毛细循环中的尿酸一部分进入血循环，一部分再被肾近端小管 上皮细胞重吸收，此过程可能与0 A T l 和0 A T 3 有关“。E r d m a n 等“研究发现，h O A T 3 是一个有机阴离子二羧酸盐转运子，可能参与肾脏尿酸盐的转运，但具体作用机制 目前还不清楚，因其位于肾小管的基底膜，推测可能参与管周细胞摄取尿酸盐，从而 有利于尿酸铺的分泌，或者与基底膜的尿酸盐排入管周毛细血管及随后的尿酸盐重 吸收有关。O A T 3 功能降低或基因表达减弱与尿酸排泄减少有关，是高尿酸血症的重 要发病机制”。 本课题以雄性O L E T F 大鼠为研究对象，以雄性L E T O 大鼠( 与O L E T F 大鼠同系) 为对照。检测了5 1 1 周龄O L E T F 大鼠血脂水平，采用逆转录聚合酶链反应( R T P c R ) 方法测定r O A T 3 活性和m R N A 水平，探讨高脂血症对肾小管上皮细胞h 0 A T 3 活性和基因表达的影响，以揭示脂代谢紊乱与高尿酸血症问的联系，提高对高尿酸 血症发病机制的认识，为该病的早期防治和发现新的药物作用靶点，开发治疗高尿 酸血症的新药建立理论基础。 青岛人学硕十学何论文 1 1 研究对象及分组 1 1 1 研究对象 材料与方法 4 周龄雄性0 L E T F ( O t s u k aL o n g - E v a n sT o k u s h i m aF a t t y ) 大鼠和4 周龄与O L E T F 大鼠同系的雄性L E T O ( L o n 9 2 E v a n sT o k u s h i m a O t s u k a ) 大1 由R 本大冢制药公司提 供，均健康。饲养环境”“：无特殊病原体级( S P F 级) ，一笼5 只，温度( 2 3 2 ) 。C ， 湿度( 5 5 5 ) ，光照7 ：0 0 1 9 ：0 0 ，均予基础饲料( 含粗蛋I 刍2 2 ，籽脂肪3 ，碳水化 合物等7 5 ) 饲养7 周龄至】1 周龄。 1 1 2 分组 实验组：雄性O L E T F 大鼠，4 周龄，1 0 只； 对照组：与O L E T F 大鼠同系的雄性L E T O 大鼠，4 周龄，l O 只。 1 2 实验仪器 ( 1 ) 低温超速离心机( B A C K M A NU S A ) ( 2 ) 台式高速离心机( S I G M AU S A ) ( 3 )超低温冰箱( T h e r m oF o r m aU L T FF r e e e z e rU S A ) ( 4 ) 液氮冻存罐 ( 5 ) 无菌超净工作台( 北京半导体一厂) ( 6 ) 恒温水浴箱( 上海跃进医疗器械厂) ( 7 ) 旋涡混合器( 上海医科大学仪器厂x w - 9 0 4 ) ( g ) P C R 仪( A B I7 5 0 0U S A ) ( 9 )电泳仪( 美国B I O R A D 公司P A C 3 0 0 ) ( 1 0 ) 紫外透射仪( W P 9 2 1 型) ( 1 1 ) 微量移液器、匀浆器( 法国G i l s o n 德国B r a n d ) ( 1 2 )电子称量仅( M E r r L E R A E l o o ) ( 1 3 ) 电热磁力搅拌器( 深圳天南海北有限公司) ( 1 4 ) 全自动生化分析仪( 只立公司产品7 1 7 0 型) ( 1 5 )紫外分光光度分析仪( B E C KM A ND U 6 4 0U S A ) 青岛人学硕十学位论文 ( 1 6 ) 强生稳豪血糖仪( 美国强生) 1 3 实验试剂 ( 1 ) ( 2 ) ( 1 3 ) ( 1 4 ) 血生化试齐嗌t ( 青岛益信医学科技有限公司) T R I Z O L 试剂盒及定量T A K A R A 试剂盒( 大连宝生生物工程有限公 司、 R N A 提取试剂盒( T R I z o lR e a g e n tI n v i t r o g o nU S A ) 逆转录试剂盒A W V ( P r o m e g aU S A ) P C RM a s t e rM i x ( A B IU S A ) 异丙醇 无水乙醇 G A P D H 荧光探针引物( 上海生工生物工程公司合成) O A T 3 荧光探针引物( 上海生工生物工程公司合成) T a qD N A 聚合酶：浓度5 u u L ，一2 0 “ C 储存( 上海生工公司产品) M g C l 2s o l u t i o n ：浓度2 5 m M ( 上海生工公司产品) 1 0 P C R 缓冲液，l O O m MK C L ，1 0 0 r a M “ I r i s 。H L Cf P H 9 0 ，a t2 5 “ C ) ， 1 T r i t o n X 1 0 0 ( 上海生工公司产品) 去核酸酶水：5 0 m l ，2 2 2 5 存放( 上海生工公司产品) 5 X T B E 电泳缓冲液( P H 8 O ) ：T r i s5 4 9 、硼酸2 7 5 9 、0 S M E D T A N a 2 2 0 m l ，加蒸馏水至1 0 0 0 m l ( 1 5 ) 琼脂糖凝胶A g a r o s e ( 西班牙制造) ( 1 6 ) D N A M a r k e r ：1 0 0 b p D L ( B M I 公司产品) 1 4 实验方法 1 4 1 标本的采集和保存 两组大鼠均基础饲料饲养至7 周龄，禁食1 2h 后，天平测定大鼠体重；测体长： 尾尖取血测随机血糖；剪尾采血3 T C 恒温水浴半小时，取血清40 C 冰箱保存，测定 空腹血糖、血尿酸、血脂。 3 ) ) ) ) ) ) ) O 1 2 o “ 饰 “ n n 青岛人学硕叶= 掌能论文 基础饲料饲养至1 l 周龄，禁食1 2h 后，天平测定大鼠体重：测体长；尾尖取 血测随机血糖；剪尾采血3 7 “ ( 2 恒温水浴半小时，取血清4 “ C 冰箱保存。所有大鼠水 合氯醛O l m l l O O g 腹腔注射麻醉，经庄肾静脉取血5 m l ，3 7 。C 恒温水浴半小时，分 离血清4 “ C 冰箱保存，测定空腹血糖、血尿酸、血脂。活体取肾皮质，迅速置于液 氮冻存罐保存。 所有标本统一编号保存，各项指标均统一标准，一批完成测定。 1 4 2 临床及生化指标检测方法 所有大鼠均记录体重、体长； 采用强生血糖仪测末梢血以获得随机血糖值，葡萄糖氧化酶法测定静脉血糖、 血尿酸、血脂、尿素氮、肌酐。 1 4 3 提取肾皮质总R N A R N A 擒提试齐I j 盒，提取肾皮质总K N A 。具体步骤如下： 1 ) 取肾皮质冻存管放于冰台上，各取肾皮质约1 0 0 毫克剪碎周搅拌器匀浆( 冰 上) ，置于无菌的1 5 m l E p p e n d o r f 管中，加入5 0 u lT r i z o l 液振荡吹打成悬液， 室温静置5 分钟。 2 ) 取O 2 m l 氯仿加入上述E p p e n d o r f 管中，振荡颠倒混匀1 5 秒，室温静置2 3 分钟；40 C1 2 0 0 0r p m 离心1 5 分钟。 3 ) 将上层水相( 含R N A ) 转移至新管中，加入0 5 m l 异丙醇，混匀后室温静 黄1 0 分钟，颠倒混匀，可见白色丝状物悬于管中。 4 14 1 2 0 0 0r p m 离心1 5 分钟，沉淀R N A ，管壁上可见小块白色沉淀析出。 5 1 小心吸去上清异丙醇。加入l m l 7 5 乙醇( D E P C 处理后) ，倒置数次以充 分洗涤R N A 沉淀，4 下7 5 0 0r p m 离心5 分钟。 6 ) 小心吸去乙醇，再加入l m l 7 5 乙醇，充分洗涤R N A 沉淀，4 “ C 室温下7 5 0 0 r p m 离心5 分钟。 7 ) 小心吸去上清乙醇室温下自然干燥l o 1 5 分钟。 8 ) 加入3 0 u l 无水R N A 酶，5 5 6 0 “ C 水浴1 0 分钟，其问不断地轻弹管壁以充分 溶解R N A ，冷却或4 过夜。 提取的R N A 溶液所用试剂和仪器均用1 D E P C 或1 8 0 高温处理。 1 ，4 4R N A 浓度的测定及其保存 4 青岛人学硕十学位论文 取R N A l u l ( O 4 u g ) 上样于l 琼脂凝胶，I l O V 电压电泳1 5 分钟后，紫外透射 仪下观察，可见R N A 条带。 溅定R N A 浓度：在比色杯中加入l m l T E 缓冲液。放入分光光度计中读取3 2 5 n m 数值，并将仪器调零。放入含有R N A 样品的比色杯，分别于2 6 0 h m 、2 8 0 n m 波长 测O D 值。质量好的R N A ，O D 2 6 0 O D 2 8 0 在1 8 2 0 之间，作为P C R 模板的D N A 工作浓度为0 0 5 , 4 ) 1 u e C u l 。R N A 浓度u g m l = O D 2 6 0 0 0 2 。 R N A 的保存：R N A 可4 “ C 保存或低温冻存，将R N A 分装成数份，近期使用的 存放于4 “ C 。长期备存放在- 2 0 或7 0 。 1 4 ，5 逆转录( R T ) 反应 取模板1 u l 和D E P C 处理过的水7 0 “ C 孵育1 0 m i n ；旋转混匀，冰上冷却，然后 依次加入以下试剂： I O X 反应缓冲液 2 0 u l M g C h 4 0 u l d N T P2 O u l R N A 酶抑制剂( 2 5 U d )0 5 u l 逆转录缓冲液 1 5 u l O l i g o d T 引物 1 O u l 4 2 水浴4 0 m i n ，9 5 加热5 r a i n ，冷却4 * U 保存。 1 4 6 荧光定量P C R 反应 应用P c R 。州方法，扩增D N A 片段长度为1 5 3b p 。反应所用探针及引物如下： 幻h O A T 3 探针：5 - A C C G G G T G G C l _ A C C T T C A A C G G A C 一3 上游引物序列：5 C c C T T C T T C A T C T l T C C T T G T T G T - 3 下游引物序列：5 C 聪r G G T O A G C l r r T T C C C T T C C T 3 b ) G A P D H 探针：5 T c T G A C A T G C C G C C T GG A G A A A C C 3 上游引物序列： 57 C C T T c A T T G A C C T c 从C T A C A T G G 3 7 下游引物序列： 5 G C A G T G A T G G C A T G G A C T G T G G T 3 在2 0 pl 反应体系中，依次加入下列成份： 双蒸水 4 8 u l 5 青岛人学硕十学何论文 l O B u f f e r3 O u l M g C l 2 ( 2 5 m M ) 4 0 u l 4 d N T P ( 2 5 r a M ) 1 0 u l 上游引物( 5 u m o l L ) 1 0 u l 下游引物( 5 u m o l L ) 1 0 u l 探针 1 0 u l R T 产物( e D N A )4 0 u l T a q D N A 聚合酶( 5 u u 1 ) O 2 u l 内参照物G A P D H 的P C R 反应体系同上，只是引物和探针不同，实验中严格避免 R N A 酶的污染。 按如下程序扩增； 将反应体系置于P C R 扩增仪， 4 2 1 5 分钟， 9 5 2 分钟。 P C R 扩增： 9 5 预变性l O 秒， 9 5 变性5 秒， 6 0 退火+ 延伸共5 0 秒， 4 0 个循环。 1 4 7P C R 产物的检测与分析 取6ul 反应产物，在2 琼脂糖凝胶中电泳6 0 m i n ，用I m a g eM a s t e rV D S 扫描， 输入计算机，用T o t a ll a b 分析软件进行灰度分析( 见附图1 ) 。 1 5 统计学处理 所有数据用S P S S l l 0 软件分析处理，用X S 表示，各组均数之日J 的比较用方 差分析，组问两两比较采用t 检验，以P 0 0 5 为差异有统计学意义。 6 青岛人学硕十学俺论文 结果 2 1 一般资料比较 7 周龄及l l 周龄实验组O L E T F 大鼠的体重及体长较对照组L E T O 大鼠明显增 高( P O 0 5 ) ( 见表1 ) 。 2 2 各组血清生化指标水平变化 5 周龄O L E T F 大鼠的血糖、血尿酸、血脂水平与对照组L E T O 大鼠相比无明 显差异。7 周龄O L E T F 大鼠血脂水平较对照组L E T O 大鼠增高，但差别没有显著 性1 1 周龄O L E T F 大鼠血脂水平比对照组L E T O 大鼠明显增高，差异有统计学意 义( P o 0 5 ) ( 见表2 ) ；l l 周龄O L E T F 大鼠尿素氮、肌酐较对照组L E T O 大鼠无明显 差异，I l 周龄O L E T F 大鼠血尿酸水平比对照组L E T O 大鼠增高，但差别没有统计 学意义( 见表3 ) 。 2 3 高脂血症与肾小管上皮细胞r o A T 3 基因表达的相关性 P C R 扩增产物电泳显示肾小管上皮细胞r O A T 3 基因表达( 见附图) ，1 1 周龄 O L E T F 大鼠肾小管上皮细胞r O A T 3 活性和基因表达与对照组L E T O 大鼠相比明显 降低( P o 0 5 ) ( 见表4 ) 。 2 4 附表 表1 大鼠体重、体长，指数比较 T a blt h ec o m p a r i s o no f t h ew e i 曲tl e n g t ha n dl e ei n d e xo f r a g G r o u p 。a g e ( w ) n ，w e i h 舒( 劝l e n 舀h ( c m I 。l e ei n d e x L E T O 组71 02 2 4 5 8 1 7 3 31 7 0 8 20 ，7 8 1 11 03 0 1 5 8 2 5 1 51 8 1 7 1 1 90 9 l O L E T F 组 71 02 8 2 4 2 1 8 7 5 1 8 8 0 7 9 0 7 9 9 1 1 1 03 8 0 3 3 3 0 9 8 2 0 0 8 0 6 7 A0 ，9 4 注：与对照组相比，表示P 0 0 5 ，A 表示P 0 0 1 青岛人学硕十学伊论文 表2l l 周龄两组大鼠甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白比较( X S ) T a b 2t h ec o m p a r i s o no f t h eT G 、T C 、H D Lo f t h et w og r o u pr a t sa tt h ea g eo f11 w e e k s 注：与对照组相比，表示P 0 0 5 ，表示P 0 0 1 表31 1 周龄两组大鼠的尿酸、尿素氮、肌酐比较( x S ) T a b 3t h ec o m p a r i s o no f t h eU A 、C R E 、B U No f t h et w og r o u pr a t sa tt h ea g eo fl1w e e k s 注：与对照组相比无统计学意义 表4O A T 3 的基因表达比较 T a b4t h ec o m p a r i s o no f t h ee x p r e s s i o n so f t h eO A T 3g e n e s ( X S ) G R O U L 一一g e n e s a g e ( 嫩里一芝竺 L E T O 组O A T 3ll1 01 1 4 0 5 9 O L E T F 组O A T 3 1 11 0 0 3 3 - - - - - 0 1 3 注：与对照组相比，表示P 0 0 5 S 青岛人学硕士学位论文 附图：P C R 产物电泳结果 9 青岛人学硕十学位论文 讨论 痛风( G o m ) 是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病，属于多基因遗传病。其具体发病 机制尚不清楚。近年来，从基因角度对原发性高尿酸血症和痛风的病因分析发现其发 病可能由某些易感基因所致，临床研究发现，原发性痛风有明显的家族聚集性，在同卵 双生子中共显率较高，在不同种族间发病率有明显差异，提示该病与遗传因素有关。研 究衷明，与单亲有高尿酸血症和痛风者相比，双亲有高尿酸血症和痛风者病情较重、发 病年龄较轻。甚至在儿章阶段即可得病。 。 现已证实嘌呤代谢过程中关键酶的缺陷所导致的嘌呤利用障碍和( 或) 嘌呤氧化 酶的活性增强是尿酸生成增加的主要原因”1 。随着人们生活水平的不断提高和 饮食结构的变化，蛋白质、脂肪的摄入量明显增加，高尿酸、高甘油三酯血症发病 率也随着增加。临床观察已发现约有2 ，3 高血尿酸患者伴高脂血症，高甘油三酯患 者约6 0 8 0 伴发高尿酸血症。 尿酸是通过黄嘌岭脱氢酶或黄嘌呤氧化酶降解嘌呤形成的，约2 3 尿酸由肾脏 排泄，其余尿酸由消化道清除。嘌呤代谢紊乱，能量代谢异常及肾脏对尿酸的排泄 障碍均可引起血尿酸浓度升高。相关分析结果亦发现，血尿酸与T G 呈J 下相关，差异 有显著性。表明高尿酸血症与高T G 有明显的相关性。有报道显示，约有2 3 高尿酸 血症伴高脂血症，高T G 患者约6 0 8 0 伴发高尿酸血症3 。高T G 血症时，极低 密度脂蛋白的水平增高，胆固醇脂从高密度脂蛋白转化到极低密度脂蛋白，而致中 日J 密度脂蛋白的形成可增加3 倍，中自J 密度脂蛋白水平的升高导致小的致密的低密 度脂蛋白颗粒生成增加和高密度脂蛋白水平下降而致动脉粥样硬化。 高脂血症患者血尿酸水平的增加与血脂代谢密切相关的机制尚未完全明了，推 测可能是由于：( 1 ) 是否与高脂和富含嘌呤类的饮食有关。随着生活水平的提高， 富含脂肪的饮食结构导致的高脂血以及乳酸或酮酸浓度增高时，肾小管对尿酸的排 泄受到竞争性抑制而使尿酸排出减少。( 2 ) 脂质的沉积可以损害肾脏，脂质不仅在 导致肾小球损害中起重要作用，而且在肾小管损伤中亦起作用“。因此肾小管对尿 酸的重吸收与分泌比例失调，由于尿酸排出长期受阻，使血中尿酸蓄积而致高尿酸 血症。( 3 ) 胰岛素抵抗引起的血尿酸、甘油三酯和胆固醇水平的同时升高。 原发性痛风9 0 以上因尿酸排泄减少所致，目前已从分子水平证实4 种蛋白质 参与了尿酸盐的转运：产电的尿酸盐单向转运体( U A T ) 1 和有机阴离子转运体 ( O A T ) 超家族的三种转运蛋白：人尿酸盐阴离子交换器U R A T 。，0 A T l “3 和O A T 3 ”3 。 1 0 寿岛人学硬+ 学侮论文 其中人有机阴离子转运子O A T 3 基因可能与管周细胞对尿酸赫的摄取有关。 r O A T 3 c D N A 全长2 1 9 1 b p ，编码5 3 6 个氨基酸的蛋白质基因定位于ll q l1 7 ”1 。 O A T 3 在肾脏的表达量最多”1 ，对尿酸盐也有转运功能。h O A T 3 是r O A T 3 的类似物， 过去认为h O A T 3 主要与有机阴离子的分泌有关，是一个单向转运子，把有机阴离子由 细胞转运入血液循环。但B a l d a i y a 等和E r d m a n 等“实验发现，h O A T 3 不是单向转 运子，而是一个有机阴离子二羧酸盐转运子，与h O A T l 相似。可能参与肾脏尿酸虢的 转运，但具体作用机制目酊还不清楚，因其位于肾小管的基底膜。推测可能参与管周细 胞摄取尿酸盐从而有利于尿酸盐的分泌，或者与基底膜的尿酸箍排入管周毛细血管， 与随后的尿酸赫重吸收有关。 原发性高尿酸血症和痛风是一组异质性疾病，发生在遗传的基础上。综合分析不 同人群的不同表型，可对疾病有总体的认识。同时，高尿酸血症和痛风相关基因是一个 组群。其基因与基因之间是否有相互作用、各个基因是否在疾病发展的不同阶段发挥 不同的作用等问题仍值得探索。此外，在定位相关基因时，切忌在研究基因结构阶段止 步不自口，因为基因的功能研究才是方向所在，而发现基因结构改变并非研究的终点。 脂代谢紊乱和高尿酸血症密切相关，可能与遗传因素导致的尿酸排泄减少及腹 型肥胖、饮酒等环境因素有关，但分子机制仍不清楚。临床资料显示，血尿酸水平 与甘油三酯水平呈正相关，高甘油三酯血症患者，血尿酸水平常增高。但高脂血症 是否影响尿酸代谢及其可能的分子机制尚不清楚。迄今，脂代谢紊乱是否通过h O A T 3 途径影响尿酸排泄，国内外均未见相关报道。 由于转录水平的调节、交替性剪接、翻译抑制、或翻译后蛋白修饰等现象均可 以引起h O A T 3 活性的改变，因此我们不能将基因表达研究仅局限于m R N A 水平， 应在蛋白水平进一步研究脂代谢紊乱对尿酸排泄的影响。近鳇肾小管在尿酸盐的排 泄过程中发挥重要作用，肾近曲小管对尿酸盐的排泄依赖离子通道，此外，参与肾脏尿 酸排泄的尿酸盐转运蛋白尚包括I 瓜A T l 、O A T l 和h U A T 等，其中h U A T 主要参与 肾近曲小管对尿酸盐的分泌，l l U R A T l 主要参与肾近曲小管对尿酸箍的重吸收，O A T I 和0 A T I 可能与管周细胞对尿酸盐的摄取有关。h U A T 活性降低和或U R A T l 的活性 升高可能是高尿酸血症的重要发病机制。对h U A T 、O A T l 、U R A T I 基因变异与原 发性高尿酸血症相关性研究将成为今后研究的热点。在离体和整体状态下，脂代谢 紊乱对上述转运蛋白有何影响还需进一步研究。 本研究通过动物实验发现脂代谢紊乱可直接调节r O A T 3 的基因表达，随着血 脂浓度的增加，由A T 3m R N A 表达水平明显降低。由于r O A T 3m R N A 在肾近端小管、 远端小管和集合管广泛表达，是尿酸由细胞内到细胞外的转运子，进入肾近端小管 的尿酸盐5 0 由其介导分泌到细胞外，因此其功能降低或基因表达减弱与尿酸排泄 青岛人学硕十学位论文 减少有关，也是高尿酸血症的重要发病机制。因此本实验结果提示脂代谢紊乱可能 通过下调r O A T m R N A 水平，抑制肾脏对尿酸盐的排泄，导致高尿酸血症。 高尿酸血症是多基因遗传性疾病，尽管目前已对其发病机制进行了较深入的研 究，得出了部分结论，但仍有许多问题有待于解决，如，高尿酸血症的发病存在地域差 异，特定人群患者中H P R T 基因变异的主要类型是什么? 尿酸盐转运体基因突变或多 态是否为原发性高尿酸血症和痛风的重要病因? 另外，M T H F R 基因突变不仅与高尿 酸血症有关，还与闭塞性血管病变、神经管缺陷等多病因性疾病相关，其机制也有待 于进一步阐明。 青岛犬学硬七学位论文 结论 1 脂代谢紊乱时，O L E T F 大鼠肾小管上皮细胞r 0 A 基因表达降低。 2 脂代谢紊乱可直接调节r O A T 3 的基因表达 3 r O A T 3 基因表达减弱与尿酸排泄减少有关，是高尿酸血症的重要发病机制。 4 脂代谢紊乱与痛风及高尿酸血症的发病相关。 青岛人学硕十学佛论文 参考文献 1 ，C a l a b r e s eG ，S i m m o n b s l 矗。C a m e r o nJ S ，e ta t P r e c o c i o u s f a m i l i a ig o u tw i t hr e d u c e d f r a c t i o n a lu r a t ec l e a r a n c ea n d n o r m a lp u r i n ee n z y m e s Q J 3 f e d ，1 9 9 0 ，7 5 ：4 4 1 4 5 0 2 罗彦玲，邓丽丽，于红等痛风的遗传度及遗传方式的研究中华内分泌代谢杂 志，1 9 9 7 ，3 ：1 2 6 1 2 7 3 C h e n gL S ，C h i a n gS L ，T ul i p 。e ta 1 G e n o m ew i d e sc a nf o r g o u t i nT a i w a ne s e a b o r i g i n e s r e v e a l sl i n ka g et oc h r o m o s o m e4 q 2 5 埘B u m G e n e t ，2 0 0 4 ，7 5 ：4 9 8 - 5 0 3 4 N a a l o u f ，N a i mM ，C a m e iO i l ，e ta 1 N o v e li n s i g h t si n t o t h ep a t h o g e n e s i so fu r i c a c i dn e p h r o “t h i a s i s L i p p i n c o t tW i l l i a m s W il k i n s ，I n c2 0 0 4 ，1 3 ( 2 ) ：1 8 1 1 8 9 5 C h aS 1 ，S e k i n eT ，F u k u s h i m aJ I ，e ta 1 I d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fh u m a n o r g a n i c a n i o nt r a n s p o r t e r3 e x p r e s s i n gp r e d o m i n a n t l yi nt h ek i n d e y M 0 1 P h a r m a c o l ，2 0 0 l ，5 9 ：1 2 7 7 1 2 8 6 6 B o s o y a m a d a ，M a k o t o ，I c h i d a ，e ta 1 F u n c t i o na n dL o c a l i z a t i o no fU r a t eT r a n s p o t t e rli nM o u s eK i d n e y T h eA m e r i c a nS o c i e t yo fN e p h r o l o g y 2 0 0 4 ，1 5 ：2 6 1 2 6 8 7 E n o m o t oA ，K i m u r al i ，C h a i r o u n g d u aA ，e ta 1 M o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o no far e n a l u r a t ea n i o ne x c h a n g e rt h a tr e g u l a t e sb l o o du r f l t el e v e l s N a l u r e 2 0 0 2 ，4 1 7 ： 4 4 7 4 5 2 8 M a a l o u f ，N a i mM ，C a m e r o n ，e ta 1 N o v e li n s i g h t si n t ot h ep a t h o g e n e s i so fu r i c a c i dn e p h r o l i t h i a s i s L i p p i n c o t tW i l l i a m s W i l k i n s ，l n c2 0 0 4 。1 3 ( 2 ) ：1 8 1 1 8 9 9 K u s u h a r aH ，S e k i n et ，u t s u n o m i y a T a t e n ，e ta 1 M o l e c u l a re l o n i n a dC h a r a c t e r i z a t i o no fan e wM u l t i s p e c i f i cO g a n i cA n i o nT r a n s p o t e rf r o m R a tB r a i n JB i o l c h e m ， 1 9 9 9 。2 7 4 4 0 0 9 的雄性后裔与其体重大致J 下常的9 1 0 周的姐妹交配，经过2 0 代的传代筛 选，1 9 8 4 年成功地建立了一种自发性2 型糖尿病鼠种- - - O L E T F ( O t s u k aL o n g E v a n s T o k u s h i m a F a t t y ) 大鼠。近1 0 余年来，日本学者对该鼠进行了大量的研究。O L E T F 大鼠 贪食，不好运动，自第5 周起体重较对照组明显增加，1 6 周龄其平均体重为5 0 0 9 ，2 4 周 龄平均体重增至6 0 0 9 ，4 0 周龄平均体重可达7 5 0 9 。在糖尿病的早期尿糖增加体重可 轻度下降，糖尿病程度越重，体重的减轻就越明显(