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解螺旋陪伴医生科研成长 1 / 12 2018 年国家自然科学基金年国家自然科学基金面上面上项目项目 示例版示例版 题目： 真核起始因子题目： 真核起始因子 X-Y 轴调控糖基转移酶对肠癌肝转移的轴调控糖基转移酶对肠癌肝转移的 作用作用机制机制 摘要摘要： 大肠癌术后复发转移中，肝、肺转移是最常见的转移模式，对其机制一直未能阐 明。 申请者在前期工作中建立了大肠癌远处转移的特征分子谱式，在肝转移相关 分子标志中，发现真核起始因子 Z 家族的成员：X 和 Y 具有关键调节作用。X-Y 轴能够介导大肠癌肝转移的发生，X 可促进细胞获得运动能力，并且在转移灶中 通过 Y 的相互作用促进细胞异常增殖。进一步实验证实，X 能调节下游糖基转 移酶， 可能存在激活肠癌细胞膜表面半乳糖残基，从而通过与肝细胞膜上特异性 受体相互作用而使肠癌细胞“定居”于肝脏的机制，可见 X-Y 调节轴对于大肠 癌肝转移至关重要。本项目拟在此基础上，从大样本回顾性分析中总结 X-Y 对 于结肠癌肝转移的临床相关性和预后判断价值。同时，在细胞和动物模型中进一 步深入探讨其在结肠癌肝转移调控中的作用方式和调控分子机制， 解析下游效应 途径及靶点。 解螺旋 解螺旋陪伴医生科研成长 2 / 12 （一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字） ：字） ： 一、立项依据一、立项依据 大肠癌是一种发生在结肠或者直肠中的癌症，是最常见的恶性肿瘤之一，全 球每年新发病人约八百万，占所有恶性肿瘤的 10%-15%，其发病率和死亡率居 恶性肿瘤的第三位1。随着手术、化疗、放疗水平的提高，大肠癌患者的生存率 有了较大的提高，但远处转移是影响其预后的最主要因素。在美国大肠癌中有 90%的死亡由肿瘤的远处转移所致2。所以，通过对通过对大肠癌大肠癌转移机制转移机制的的研究，正研究，正 确认识确认识大肠癌大肠癌术后转移模式，对于制定合理的术后随访方案，采取有针对性的术后转移模式，对于制定合理的术后随访方案，采取有针对性的 干预措施，提高生存率至关重要干预措施，提高生存率至关重要。 大肠癌最常见的远处转移部位是肝脏和肺。对于肝转移， 人们更多的把原因 归结为解剖因素，结肠是通过门静脉系统回流进入肝脏，所以认为大肠癌的首发 转移部位往往在肝脏。 但是很多临床研究发现大肠癌患者术后转移可以绕开肝脏 而首先出现在肺部甚至是甲状腺转移3-6，有报道出现首发肺转移的大肠癌患者 最高可达患者总数的 6%，已经相当可观7，这就对我们的随访策略提出挑战， 对于大肠癌患者即使术后没有肝转移，也不能放松对肺部的检查。而申请者在前 期临床研究中，通过对本院 486 例行根治手术的大肠癌患者资料研究后发现：主 要通过门静脉系统回流的高位直肠癌和通过体循环回流的直肠中、 低位直肠癌的 术后肺转移率和肝转移率都没有显著性差异。 由此可见， 决定决定大肠癌大肠癌的术后转移的术后转移 模式的因素模式的因素并非仅仅解剖可以阐释并非仅仅解剖可以阐释。 近年来研究发现包括原发肿瘤的分期， 术前 放化疗，转移靶器官的微环境等因素都会影响大肠癌的转移模式8-10，但其确切 机制仍然没有探明。解螺旋 为搜寻大肠癌远端转移相关分子靶标并评估其作为预测远端转移发生的潜 在分子标志物的可能性， 我们前期在临床上收集了我们前期在临床上收集了 6 例例珍贵珍贵的同时性肝、 肺转移的同时性肝、 肺转移 分别切除分别切除的患者，的患者，将其将其原发灶、原发灶、肝肝、肺转移的肺转移的组织组织样本通过高通量的基因芯片样本通过高通量的基因芯片 技术，从全基因表达谱的角度对这两种转移组织的基因表达情况进行了全方位技术，从全基因表达谱的角度对这两种转移组织的基因表达情况进行了全方位 的检测的检测分析分析（来源于同一患者的组织样本可以排除个体遗传背景的干扰） 。我们 发现：有 41 个基因在两种大肠癌远处转移组织中存在显著性差异（肝转移分子 群有 27 个，肺转移分子群有 14 个） ，这些分子可能构成了驱动大肠癌不同转移 模式的分子因素。为进一步确认芯片的结果，我们在 47 例大肠癌肝转移和 22 解螺旋陪伴医生科研成长 3 / 12 例肺转移组织病理样本中，通过 qPCR 的方式进行了回顾性验证，确认了 13 个 在大肠癌肝转移过程中明显高表达的基因（5 倍以上） ，区别于肺转移，这是一 种特异性的表达改变（见前期工作） 。 这些这些肝转移特异的肝转移特异的分子分子标志标志中， 有两个属于真核起始因子中， 有两个属于真核起始因子 Z 家族的成员：家族的成员：X 和和 Y，引起了我们的研究关注。，引起了我们的研究关注。Z 真核起始因子在真核生物翻译起始过程中起着 重要作用， 参与了真核生物翻译起始过程中的多个反应11， 但其在肿瘤中的角色 功能还尚不十分清楚。 我们首先鉴定了 Y 基因在大肠癌细胞中高表达， 并确认 Y 表达被干扰后，细胞增殖能力被显著抑制，处于 G1 期的细胞数量显减少，处于 S 期和 G2 期的细胞数量显著增加，细胞凋亡比例显著提高，细胞的存活能力显 著下降，克隆形成能力受到显著抑制。这一结果已发表于已发表于XXX12。考虑到 有报道 X 与 Y 之间存在相互结合13-14，我们又进一步观察了两者之间的交互作 用。有意思的是，X 对于 Y 的促恶性增殖功能是必需的，表现在沉默 X 表达之 后，过表达 Y 对大肠癌细胞的增殖调控失活。而 X 本身具有调节细胞迁移的能 力，抑制 X 可显著降低细胞运动性（见前期工作） 。由此，我们提出科学假设： 真核起始因子真核起始因子 X-Y 轴能够调控大肠癌肝转移的发生，轴能够调控大肠癌肝转移的发生，X 可可介导细胞获得运动能介导细胞获得运动能 力，并且在转移灶中力，并且在转移灶中调节调节 Y 发挥促进肿瘤细胞继发性增殖的作用发挥促进肿瘤细胞继发性增殖的作用，具体作用机 制有待阐明。解螺旋 在哺乳动物中，Z 因子的亚基有 8 种，按分子量从大到小排列而命名15。Z 因子参与真核细胞翻译过程， 而调节蛋白合成在维持细胞生长控制中起重要作用 16。据报道，Z 因子不仅能通过促进 mRNA 与 40s 亚基结合，而且还可以独自 与游离的 40s 亚基结合，影响 40s 亚基与 60s 亚基及其他亚基蛋白的结合或解离 等17。 Z 家族成员一般含有 PCI 和 MPN 结构域， 这两类结构域都参与蛋白-蛋白 相互作用，部分还具有 RNA 识别（RNA recognition motif，RRM）结构域，可 能参与 RNA 的结合15。除此之外，Z 因子还被发现具有调控细胞周期的作用 16,18。通过调节不同类型的 mRNA 的翻译起始，Z 因子就可以选择性地调控蛋 白的合成，从而对肿瘤细胞的生长的转移等生物学行为进行调控16,19。 Z 家族中部分成员已证实在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色，已报道的包 括：A、B、C、D 等18-22。Y 的致癌作用的致癌作用由申请人由申请人首先报道，随后其在胶质瘤和首先报道，随后其在胶质瘤和 呼吸系统呼吸系统肿瘤中的作用也被其他研究者发现肿瘤中的作用也被其他研究者发现 12,23-25。而关于而关于 X 与恶性肿瘤的关与恶性肿瘤的关 解螺旋陪伴医生科研成长 4 / 12 系目前还未见文献报道，可见在针对系目前还未见文献报道，可见在针对 X、Y 两个分子尤其是交互作用方面，申请两个分子尤其是交互作用方面，申请 人人尚尚居于领先居于领先的研究地位的研究地位。 更早前， 权威杂志 J Biol Chem 上的报道提示了 X 在包含 Y 蛋白的复合物与 40S 核糖体亚基结合的过程中扮演着关键的链接作用， 缺失 X 时两者的结合很不 稳定，对翻译起始系统的调节能力也会降低26。2013 年 9 月，J Biol Chem 上又 报道了 W 可与 X 竞争性结合 Y27，从而形成不同的 Z 复合物。Z 复合物负责招 募 tRNA 或 mRNA，可调节下游基因表达，继而影响肿瘤细胞的生长、迁移等生 物学过程。不同的 Z 因子蛋白结合可能存在不同的翻译调节机制从而执行不同 功能作用。解螺旋 在近期的研究工作中，申请人对 X 的调控机制进行了进一步深入。敲减敲减 X 后，基因芯片检测显示肠癌细胞中多个关键调控节点发生了改变。其中，有后，基因芯片检测显示肠癌细胞中多个关键调控节点发生了改变。其中，有 3 个半乳糖基转移酶（个半乳糖基转移酶（1,3-GalT; 1,4-GalT-1; 1,4-GalT-7）的表达降低了，）的表达降低了， 这引起了我们的这引起了我们的兴趣兴趣。 糖基化作为常见的蛋白翻译后修饰， 参与细胞增殖、 分化、 转移、侵袭、免疫应答等多种生命活动，糖基化紊乱能够导致多种肿瘤的发生与 恶性转化， 糖基转移酶的表达和活性与包括大肠癌在内的多种肿瘤的恶性化程度 相关28-29。 Tang 等发现1,4-半乳糖基转移酶 1 通过调节 EGFR 影响肝癌细胞的 生长和凋亡30。1,4-半乳糖基转移酶 3 通过调节整联蛋白信号通路影响神经细 胞瘤的侵袭能力31。此外，半乳糖基转移酶的激活，可以使细胞膜上蛋白糖基 化程度增加32。 经过进一步肠癌细胞株的体外实验验证， X 与半乳糖基转移酶1,4-GT-1 和 1,4-GT1-7 的表达正相关（见前期工作） ，我们推测我们推测 X 对半乳糖基转移酶的调对半乳糖基转移酶的调 节作用很可能是它在肠癌中介导肿瘤细胞肝转移的关键节作用很可能是它在肠癌中介导肿瘤细胞肝转移的关键。 原因在于， 肝细胞表面 存在一种特异性表达的抗原：去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor, ASGPR） ，又称半乳糖受体。ASGPR 是一种跨膜蛋白，主要表达于哺乳动物肝 窦状隙的肝实质细胞表面，密度很高，每个细胞表面可多达 500,000 个受体，其 胞外结构域含有糖识别结构域，能识别和结合半乳糖残基和-乙酰半乳糖胺残 基33。 Misawa 等34曾经用神经氨酸酶处理骨髓细胞 （Bone marrow cell， BMCs） ， 使细胞膜表面的糖蛋白脱去唾液酸而暴露出半乳糖残基，利用半乳糖残基与 ASGPR 的相互作用使 BMCs 直接聚集到肝脏。我们相信，真核起始因子真核起始因子 X 在肠在肠 解螺旋陪伴医生科研成长 5 / 12 癌肝转移的过程中，可能调节下游糖基转移酶，存在一种通过激活肠癌细胞膜癌肝转移的过程中，可能调节下游糖基转移酶，存在一种通过激活肠癌细胞膜 表面半乳糖残基， 从而与肝细胞膜上特异性受体表面半乳糖残基， 从而与肝细胞膜上特异性受体 ASGPR 相互作用而使肠癌细胞相互作用而使肠癌细胞 “定居”于肝脏的机制，此后，它又可介导“定居”于肝脏的机制，此后，它又可介导 Y 的促进肿瘤细胞克隆化增殖的能的促进肿瘤细胞克隆化增殖的能 力， 最终形成肝组织肿瘤转移灶力， 最终形成肝组织肿瘤转移灶。 X-Y 调节轴对于大肠癌肝转移的内在调节机理 是令人期待的。解螺旋 在前期工作基础上，本项目拟从大样本回顾性分析中总结 X-Y 对于结肠癌 肝转移的临床相关性和预后判断价值。同时，在细胞和动物模型中进一步深入探 讨其在结肠癌肝转移调控中的作用方式和调控分子机制：解析 X 调节半乳糖苷 转移酶表达的方式和作用靶点，明确其介导的信号通路，并确认 X 在 Y 复合物 发挥功能的效应分子途径中的作用。 以上研究在组织、 细胞、 动物三个层次展开， 并通过分子机制研究进行纵向的突破，以期获得高水平的研究成果。 本项目是对结肠癌肝转移发生机制的研究深入， 所获得的研究成果可帮助我 们更好判断肠癌预后，通过肝转移特征性的分子标志，提示风险，并为相关靶点 应用于临床转化医学奠定理论基础。 主要参考文献主要参考文献 因涉敏感基因信息，略 解螺旋陪伴医生科研成长 6 / 12 二、项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题二、项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题 1、研究内容、研究内容 1) 回顾性检测 500 例肠癌患者手术标本中 X 和 Y 蛋白的表达水平，根据临床 病理数据和随访数据多因素分析 X、Y 表达与肠癌肝转移发生的相关性，尝 试建立基于 X、 Y 表达的分子预测模型， 评价这一预后指标的临床适用价值。 2) 在肠癌细胞株中过表达和沉默 X、Y 基因，观察细胞功能变化。在细胞实验 基础上，应用裸鼠成瘤和肝转移动物模型进行验证，观察 X、Y 对于肠癌恶 性增殖和转移发生的影响。结合细胞、动物和组织水平的研究数据阐明 X、 Y 在肠癌发生、进展中的功能作用。解螺旋 3) 根据前期工作的下游通路和靶分子分析结果，重点阐明：X与糖基转移酶 之间的调控关系和作用靶点；X 与细胞运动性信号通路靶分子的调节关 系；Y 复合物调节的信号通路与效应分子；X 与 Y 相互结合的序列位 点和精细调控。解螺旋 2研究目标及考核的技术指标研究目标及考核的技术指标 基于 Y 在肠癌细胞高表达能促进细胞恶性增殖和周期改变，X 与 Y 之间存 在相互结合，而 X 具有调节细胞迁移的能力，申请者的研究目标在于证实 X-Y 轴能够调控大肠癌肝转移的发生， X 可介导细胞获得运动能力并在转移灶中调节 Y 发挥促进肿瘤细胞继发性增殖的作用。而在体内、体外明确其促肝转移功能作 用基础上，X 调控结肠癌细胞迁移的分子机制通过以下两个目标进行深入探讨： 1) 阐明 Y 复合物调节的信号通路与效应分子； 2) 确认 X 与 Y 相互结合的序列位点和精细调控； 3）探讨 X 调节大肠癌肝转移模式的具体作用机制。 3拟解决的关键科学问题及其解决方法拟解决的关键科学问题及其解决方法 本课题所需解决的第一个关键科学问题为 X 和 Y 在大肠癌肝转移中的临床 意义， 通过大样本组织中检测这两个分子的表达，并利用病理和随访数据进行统 计分析，我们可以获得多因素条件下这两个靶标的临床价值。这其中，规范化的 组织样本库，随访数据的积累以及统计方法的运用都是重要的影响因素，但申请 解螺旋陪伴医生科研成长 7 / 12 者所在课题组在这方面从事过多个课题的研究，具有丰富经验。另一方面，这两 个靶标的检测有成熟的商业化抗体，方法学上也不存在困难。 本课题第二个关键问题也是本课题研究的重点，即 X-Y 轴在大肠癌肝转移 中的调控分子机制，我们需要阐明 Y 所介导的迁移功能及糖基转移酶信号途径 的效应分子和作用方式，并且确认 Y 与 X 结合的精细调控及促进肿瘤细胞增殖 的分子机制。 这方面的工作依赖于扎实的前期工作，首先，我们已经得到 Y 和 X 沉默后功能表型的结果，即 Y 可调控细胞增殖，而 X 能够调节细胞迁移，并影 响 Y 对肿瘤的促增殖作用，在此基础上做机制研究有的放矢。其次，我们已筛 查和验证到 X 可通过调节两个糖基转移酶对肠癌细胞肝脏种植起到调节作用， 在本课题中，我们需要深入做的工作是揭示 X 如何调节细胞迁移功能，其下游 调节糖基转移酶是否与肝脏特异性的转移相关， 以及它们具体的作用机制是怎样 的。在逻辑清晰的机制通路假设中，我们只需逐条验证，即可真正揭开 X 作用 通路的神秘面纱。最后，Y 和 X 之间的 cross-talk 有创新性且立足于前期研究的 数据支持，只需将 X-Y 复合物调节的位点和下游与细胞增殖功能相关的机制阐 释清楚，即可形成完成的研究故事。考虑到肿瘤细胞增殖机制方面报道众多，可 参考模式丰富， 这方面的研究也不会有太大的科学风险。 解螺旋 解螺旋陪伴医生科研成长 8 / 12 三、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析三、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 1. 技术路线技术路线 Y基因基因RNAiRNAi慢病毒慢病毒 Y沉默后沉默后SWSW11161116细胞增殖能力显著细胞增殖能力显著 降低降低 感染感染 基因芯片鉴定基因芯片鉴定X、Y在肠癌肝转移组织中特异性高表达在肠癌肝转移组织中特异性高表达 X X- -Y Y轴可能调控大肠癌肝转移的发生轴可能调控大肠癌肝转移的发生 500500例肠癌组例肠癌组 织和肝转移组织和肝转移组 织样本的收集织样本的收集 基因芯片筛选基因芯片筛选X X沉默沉默 后下游分子变化后下游分子变化 半乳糖基转移酶抑制剂半乳糖基转移酶抑制剂 验证其在验证其在X X介导肠癌细介导肠癌细 胞肝转移中的作用胞肝转移中的作用 EMSAEMSA/ /CoCo- -IPIP实验实验 验证验证X-Y的RNA/蛋 白相互作用 in vivoin vivo验证验证X X- -Y Y轴轴 对肠癌细胞肝转对肠癌细胞肝转 移能力的影响移能力的影响 免疫组化检免疫组化检 测测X、Y蛋白蛋白 表达和定位表达和定位 根据临床的病理资根据临床的病理资 料料/ /预后和随访资料预后和随访资料 分析分析X、Y表达对肠 癌预后的临床意义的临床意义 X沉默后沉默后SWSW11161116细胞增殖被抑制细胞增殖被抑制， 迁移能力显著降低迁移能力显著降低 X基因基因RNAiRNAi慢病毒慢病毒感染感染 X基因过表达慢病毒基因过表达慢病毒 Y Y沉默后沉默后，过表达过表达X X，SWSW11161116细胞细胞 增殖有稍许增强增殖有稍许增强 感染感染感染感染 X沉默后，过表达Y对SWSW11161116细胞细胞 增殖增殖、迁移无显著影响迁移无显著影响 Y基因过表达慢病毒基因过表达慢病毒 裸鼠肠癌肝转移模型裸鼠肠癌肝转移模型 半乳糖基转移酶可半乳糖基转移酶可 能是能是X X调节肠癌细胞调节肠癌细胞 肝转移模式的关键肝转移模式的关键 qPCRqPCR、WBWB验证验证X X对半对半 乳糖基转移酶的调控乳糖基转移酶的调控 对对X X的序列进行分段的序列进行分段，分别分别 构建载体构建载体，用用CoCo- -IPIP的方法的方法 检测与检测与Y Y结合的区域结合的区域 对目标序列区域进行对目标序列区域进行 分析分析，设计点突变设计点突变， 验证验证XYXY结合的位点结合的位点 阐明阐明X X- -Y Y在肠癌肝转移在肠癌肝转移 模式中的作用及机制模式中的作用及机制 in vivoin vivo验证验证X X- -Y Y轴轴 对肠癌细胞体内成对肠癌细胞体内成 瘤能力的影响瘤能力的影响 裸鼠移植瘤模型裸鼠移植瘤模型 备注：蓝色背景填充部分为前期已完成工作。解螺旋 2. 研究方法研究方法 2.1 X、Y 在结肠癌发生、发展中的作用和预后相关性在结肠癌发生、发展中的作用和预后相关性 1) 回顾性收集肠癌临床标本 500 例，取手术切除的肠癌组织、匹配的肝脏转移 灶手术和穿刺标本，新鲜组织液氮保存标本 200 例，石蜡块 300 例，全部病 例均通过临床、影像学、病理诊断，术前未进行辅助治疗，来自某某医院 2008-2013 年临床收治病例，随访资料齐全。 解螺旋陪伴医生科研成长 9 / 12 2) 免疫组化检测组织切片中 X、Y 蛋白的表达及定位，分别设立阴性对照、肿 瘤对照、肝转移对照。解螺旋 3) SPSS16.0 统计软件对 X、 Y 表达及定位与临床标本进行病理关联性分析和预 后统计分析，了解 X、Y 表达情况与相关临床资料之间的关系，单因素生存 分析对临床各项指标与结肠癌生存期进行相关性分析， 建立 Cox 比例风险回 归模型，综合探讨临床各因素和 X、Y 表达与结肠癌肝转移、转移灶形成及 预后的相关性。 2.2 体外、体内水平研究体外、体内水平研究 X、Y 基因在肠癌肝转移中的调节功能基因在肠癌肝转移中的调节功能 1) 制备 X-shRNA 慢病毒，建立 X 稳定沉默的细胞株，以无义序列作为阴性对 照，利用 MTT 实验观察 X 沉默后细胞的生长曲线；克隆形成实验检测 X 沉 默后细胞的克隆形成能力；流式细胞术结合 PI 单染、Annexin-V 双染检测细 胞周期和凋亡情况； 细胞划痕实验、 Transwell 实验观察细胞运动能力的变化。 与此同时，制备过表达 X 的慢病毒载体。 2) 在稳定沉默 X 的结肠癌细胞中，导入过表达 Y 的慢病毒载体，利用细胞生 长曲线观察 X 沉默且 Y 过表达后细胞的增殖能力变化；细胞划痕实验、 Transwell 实验观察细胞运动能力的变化。同样地，在稳定沉默 Y 的结肠癌 细胞中，导入过表达 X 的慢病毒载体，利用细胞生长曲线观察 Y 沉默X 过 表达后细胞的增殖能力变化；细胞划痕实验、Transwell 实验观察细胞运动能 力的变化。 3) 制备结肠裸鼠皮下移植瘤模型，观察肿瘤生长情况，建立生长曲线，统计分 析 Y 和 X 对结肠癌细胞体内成瘤能力的影响，明确 Y 和 X 在结肠癌恶性增 殖的作用。实验分组：空白对照、Y 沉默组、X 沉默组、X 沉默组+Y 过表 达组、Y 沉默组+X 过表达组。解螺旋 4) 建立结肠癌肝转移动物模型，观察肝脏中的转移灶，统计分析 Y 和 X 对结 肠癌肝转移能力的影响，明确 Y 和 X 在结肠癌肝转移过程中的作用。实验 分组：空白对照、Y 沉默组、X 沉默组、X 沉默组+Y 过表达组、Y 沉默组 +X 过表达组。解螺旋 5) 处死裸鼠取得的肿瘤组织，利用 qRT-PCR 和免疫组化方法检测 Y/X 以及下 解螺旋陪伴医生科研成长 10 / 12 游半乳糖苷酶的 mRNA 和蛋白的表达；部分肿瘤组织制备成冰冻切片，利 用 FITC 和 TRITC 双标记免疫荧光染色， 使用激光共聚焦显微镜观察 X 与 Y 的共定位情况。 2.3. X-Y 轴调节结肠癌肝转移的分子机制研究轴调节结肠癌肝转移的分子机制研究 1) 通过基因芯片 Microarray 分析 X 过表达/沉默后基因表达谱变化情况，对原 始数据进行归一化、标准化，差异表达分析，明确 X 消减后表达发生改变的 下游调控分子，芯片结果中有显著差异的潜在作用分子，设计引物，通过 qRT-PCR 进行二次表达验证。解螺旋 2) X 基因过表达/沉默后发生显著表达差异的基因，利用 Bayesian Network、 Genes2Networks、Go-anaslysis 软件进行 signaling network 重建。解析 X 调 控结肠癌细胞运动能力的信号通路网络，构建 X 为核心的信号分子网络。 3) 根据 X 基因沉默后影响的信号通路结果 （半乳糖基转移酶及其上游调节信号 通路） ，利用信号通路抑制剂处理 X 稳定过表达/沉默后结肠癌细胞和对照细 胞，检测不同分子信号对 X 表达及功能的作用，验证阻断这些信号通路后对 X 在结肠癌中的功能表型的影响。 4) 采用信号通路高通量检测蛋白芯片，根据以上实验分析的通路情况，订购相 应通路的 Pathway Array 试剂盒，按试剂盒操作，依据封闭、加入细胞裂解 液、洗脱、加入抗体混合液、再次洗脱，加入辣根过氧化物酶 HRP 并洗脱、 信号检测的步骤，检测 X 基因表达变化后的特定通路关键蛋白的变化。 5) 分别构建 X、Y 的真核表达载体，共转 293T，通过免疫共沉淀（Co-IP）验 证 XY 的相互结合作用。 6) 应用生物信息学技术模拟 X 与 Y 的结合位点。在结合位点制备不同氨基酸 的突变体。 采用 RNAi 方法敲减互作蛋白表达， 接着转入互作蛋白的突变体， 检测细胞功能表型变化。通过免疫共沉淀（Co-IP）验证 X 与 Y 之间的结合 位点特异性。 7) EMSA 实验验证 X 与 Y 之间的相互作用关系，参考蛋白相互作用实验，设 计突变载体，再验证其结合特异性，由此揭示 X 作为 Y 调节蛋白其对下游 RNA 进行调控的精细机制。 解螺旋陪伴医生科研成长 11 / 12 3. 可行性分析可行性分析 1) 研究目标切实可行：我们前期的工作已明确证实：Y 可以调节结肠癌的恶性 增殖，并且进行了大量的预实验，可支持本课题主要科学假设。本项目是对 前期研究工作的进一步补充和完善，具有较好的可行性。 2) 技术平台与硬件设施完善：课题组成员长期从事结直肠癌的诊治和发生发展 机制研究，在免疫组化、免疫印迹、实时荧光定量 PCR、RNA 干扰、慢病 毒包装、表达谱芯片研究等各个方面积累了大量的经验，本项目中所用到的 实验