外泌体（电镜）.pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 1 外泌体（外泌体（电镜电镜） 1.1. 实验原理实验原理 外泌体在 30300nm 左右，需要透射电子显微镜、扫描电子显微镜或原子力显微镜才能 观察到。结合特定的染色（如负染色）可以使外泌体更加可视化。 2.2. 实验目的实验目的 观察外泌体结构并示踪特定蛋白。 3.3. 实验实验材料材料 主要仪器主要仪器 透射电子显微镜（Transmission electron microscopy， TEM） 4.4. 实验步骤实验步骤 4.1 4.1 外泌体的块状制备，切片，染色和成像外泌体的块状制备，切片，染色和成像 1. 通过以 100,000xg 离心 1.5 小时 23，从 HCT116 细胞的培养上清液中沉淀外泌体。除去 培养上清液，小心地将纯化的外泌体沉淀用 1mL 2.5戊二醛在 0.1M 二甲胂酸钠溶液 （pH7.0）中于 4固定 1 小时。对于 0.1M 二甲胂酸钠，将 4.28g 二甲胂酸溶于 160mL 蒸馏水（DW）中。用 0.1 M HCl 将 pH 调节至 7.4，然后补足用蒸馏水加至 200 毫升。 2. 取出固定剂，在室温下用 1 mL 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗沉淀。每次重复三次，每 次持续 10 分钟。解螺旋 3. 将样品用 1 mL 2四氧化锇在 4C 下固定 1 小时。 4. 取出固定剂，每 10 分钟用 0.1M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗三次。 5. 在振荡器上用分级丙酮系列（分别为 50，60，70，80，90，95，100） 孵育 10 分钟。 解螺旋 陪伴医生科研成长 2 6. 取出丙酮，孵育 3：1 丙酮：低粘度包埋混合物溶液 30 分钟。外泌体颗粒在管中。 7. 取出培养基，加入 1：1 丙酮：低粘度包埋混合物培养基，然后孵育 30 分钟。 8. 取出培养基，加入 1：3 丙酮：低粘度包埋混合物培养基，然后孵育 30 分钟。 9. 取出培养基并加入 100低粘度包埋混合物并在室温下孵育过夜。 10. 使用嵌入模具将样品嵌入纯低粘度嵌入混合物中，并在 65下烘烤 24 小时。 11. 通过超薄切片机制备厚度为 60 nm 的切片。 12. 用 2乙酸双氧铀双染 20 分钟，并用柠檬酸铅处理 10 分钟。 a) 对于雷诺铅溶液，将 1.33g 硝酸铅和 1.76g 柠檬酸钠加入总共 50mL 蒸馏水中。 13. 在 80kV 下观察透射电子显微镜下的栅格。 14. 单击“获取” ，然后在电子显微镜下在 80 kV 下在 CCD 相机系统中单击“文件”和“另 存为” 。遵循自动设置曝光时间。解螺旋 4 4.2 .2 切片和成像的免疫染色切片和成像的免疫染色 1. 使用超薄切片机切割 60nm 超薄切片，并收集在镍网格上。 2. 在 50L0.02M 甘氨酸滴中孵育网格 10 分钟以淬灭游离醛基。 3. 用 100LDW 冲洗三次，每次 10 分钟。在室温下在含有 1BSA 的 PBS 中孵育 1 小时。 4. 在 50-100L 抗 KRS 抗体 24（含有 0.1BSA 的 PBS 中 1：100）中孵育网格 1 小时（如 有必要，此步骤应为在 4C 下进行过夜。 ） 5. 用五个单独的滴剂（50L）含有 0.1BSA 的 PBS 洗涤网格，每次 10 分钟。 6. 将网格转移至第二抗体滴 1 小时（与含有 0.1BSA 的 PBS 中的 10nm 金颗粒（1：100） 缀合的抗兔 IgG） 。 7. 每 10 分钟用含有 0.1BSA 的 5 滴独立滴剂（50L）洗涤网格。 8. 在黑暗条件下用 2乙酸双氧铀双染 20 分钟，用 Reynold 枸橼酸铅分别染色 10 分钟。 9. 单击“获取” ，然后在 80 摄像机的 TEM 下，在 CCD 摄像机系统中单击“文件”和“另存 为” 。曝光时间遵循自动设置。 4 4.3 .3 负染色负染色 1. 通过辉光放电器将薄的 formvar /碳膜涂覆的 200 目铜 EM 网格放电 1 分钟。 2. 用 1 mL 2多聚甲醛（PFA）固定纯化的外泌体 5 分钟。 a) 注意：多聚甲醛烟雾有毒。所有工作都应在通风的通风橱中进行。 解螺旋 陪伴医生科研成长 3 3. 在网格上加载 5 - 7L 外泌体悬浮液，孵育 1 分钟。如果外泌体浓度过高，则稀释浓 度为 1/2 - 1/5。解螺旋 4. 立即用注射器在 EM 网格表面上用20 滴过滤的 1乙酸双氧铀（UA）溶液染色。 5. 通过将网格边缘与滤纸接触，去除网格上多余的 UA 溶液。 6. 用一滴水快速冲洗网格。该步骤将除去过量的染色溶液。 7. 用镊子夹住网格，然后用培养皿部分盖住网格，在室温下干燥 10 分钟。 8. 将网格存储在 EM 网格盒中，以便将来通过 80 kV 的 TEM 观察。 4 4.4 .4 整体用于免疫染色整体用于免疫染色 1. 将薄的 formvar /碳膜涂覆的 200 目铜 EM 网格辉光放电 30 秒。 2. 用 1 mL 2多聚甲醛（PFA）固定纯化的外泌体 5 分钟。注意：多聚甲醛烟雾有毒。所 有工作都应在通风的通风橱中进行。 3. 在网格上加载 5 - 7L 固定的外泌体溶液并孵育 5 分钟。用 100LPBS 冲洗三次，每 次 10 分钟。 4. 用 50L0.05M 甘氨酸处理网格 10 分钟以淬灭游离的醛基。 5. 将网格转移到一滴封闭缓冲液（含有 1BSA 的 PBS）中 30 分钟。 6. 用 50-100L 抗 PD-L1 抗体（在含有 0.1BSA 的 PBS 中 1：100）孵育网格 1 小时（如 果需要，该步骤应在 4下进行过夜） 。 7. 用五个单独的滴剂（50L）含有 0.1BSA 的 PBS 洗涤网格，每次 10 分钟。 8. 将网格转移至一滴第二抗体 1 小时。 在含有 0.1BSA 的 PBS 中以 1： 100 稀释的 9-11nm 金颗粒缀合的抗小鼠 IgG。 9. 用含有 0.1BSA 的 5 滴独立滴剂 （50L） 洗涤网格各 10 分钟。 用两个单独的液滴 （50 L）DW 洗涤网格。 a) 如上节 4 至 8 所述，用 2乙酸铀酰进行负染色。 10. 将网格存储在 EM 网格盒中，以便将来通过 80 kV 的 TEM 观察。 5.5. 应用示例文献应用示例文献 1,21,2 1. Wan S, Zhang L, Wang S, et al. Molecular Recognition-Based DNA Nanoassemblies 解螺旋 陪伴医生科研成长 4 on the Surfaces of Nanosized Exosomes. J Am Chem Soc 2017; 139139(15): 5289-92. 2. Al-Dossary AA, Bathala P, Caplan JL, Martin-DeLeon PA. Oviductosome-Sperm Membrane Interaction in Cargo Delivery: DETECTION OF FUSION AND UNDERLYING MOLECULAR PLAY