NY T 402-2000 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程.pdf

B1 5N .,中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y / T 4 0 2 -2 0 0 0脱毒甘薯种薯( 苗) 病毒检测技术规程Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s - f r e e s e e d ( s e e d l i n g ) s w e e t p o t a t o e s2 0 0 0 一 0 9 一 2 2 发布2 0 0 0 一 1 2 一 0 1 实施中华人民共和国农业部发 布N Y/ T 4 0 2 -2 0 0 0前言 为了有效地实施对脱毒甘薯种薯( 苗) 质量检验和管理， 规范脱毒甘薯种薯( 苗) 市场， 促进甘薯脱毒技术推广， 实现脱毒甘薯种薯( 苗) 病毒检测的规范化、 标 准化， 特制定本规程。 本规程在参照国内外甘薯病毒检测技术最新研究进展的 基础上， 结合当前国内生产实际， 力求达到快速、 准确、 可操作性强的检测要求。 检测对象主要选择生产上发生分布范围广、 危害性大的 病毒。 检测方法主 要采用指示植物检测和斑点酶联免疫吸附检测方法。 本规程内容包括脱毒甘薯种薯( 苗) 病毒检测的适用范围、 检测对象、 抽样方法、 检测方法和质量要求。 本标准的附录A、 附录B都是标准的附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准主要起草单位: 农业部植物脱毒种苗质量监督检验测试中心( 济南) 、 山东省植物保护总站。 本标准主要起草人: 孙作文、 商明清、 李明立、 刘敬东、 杨勤民、 任宝珍。中华人民共和国农业行业标准脱毒甘薯种薯( 苗) 病毒检测技术规程N Y / T 4 0 2 -2 0 0 0Ru l e s f o r v i r u s d e t e c t i o n o f v i r u s - f r e e s e e d ( s e e d l i n g ) s we e t p o t a t o e s1 范围 本标准规定了脱毒甘薯种薯( 苗) 的病毒检测方法和 操作规程。 本标准适用于脱毒甘薯种薯( 苗) 的病毒检测。2 定义 本标准采用下列定义。2 . 1 脱毒苗 应用茎尖组织培养技术获 得的再生试管苗， 经检测确认不带甘薯羽 状斑驳病毒( S P F M V ) 和甘落潜隐病毒( S P L V) ， 才确认是脱毒苗。2 . 2 脱毒种薯( 苗) 从繁殖脱毒苗开始， 经 逐代繁殖增加种薯( 苗) 数量的种薯( 苗) 生产 体系 生产出来的。 分原原种、 原种、 生产用种三个级别。2 . 2 . 1 原原种 p r e - e l i t e 用脱毒苗在防虫网室、 温室条件下生产的符合质量标准的种薯( 苗) 。2 . 2 . 2 原种e l i t e 用原原种作种薯， 在良好隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯( 苗) 。2 . 2 . 3 生产用种 c e r t i f i e d s e e d o r s e e d l in g 用原种作种薯， 在隔离条件下生产出的 符合质量标准的种薯( 苗) 。2 . 3 病毒病株允许率 指各级甘薯种薯( 苗) 繁殖田中 病毒病株的允许比 率。3 检测对象 甘薯羽 状斑驳病毒( S w e e t p o t a t o f e a t h e r y m o t t l e v i r u s , S P F M V ) = 甘薯潜隐 病毒( S w e e t p o t a t o l a t e n t v i r u s , S P L V ) ,4 抽样41 组培苗抽样4 . 1 . 1 脱毒核心材料: 每株必须检测。4 . 1 . 2 扩繁苗: 随机抽取 l 0 o -2 %的扩繁苗检测。4 . 2 田间抽样4 . 2 . 1 原原种和原种抽样: 定植后 3 0 天、 6 0 天、 收获前 2 周， 在目测全田的基础上， 采用五点取样法，中华人民共和国农业部2 0 0 。 一 0 .0 9 一 2 2 批准2 0 0 0 - 1 2 一 0 1 实施 t N Y/ T 4 0 2 -2 0 0 0抽样数量为。 . 1 h m 以下2 0 0 株; o . 1 1 一 1 h m 2 5 0 0 株; 超出1 h m 面积， 划出另一检验区， 按本 规程规定的 面积取样。 每株取上、 中、 下部叶片1 -5 g ， 低温保湿存放， 2 4 h内 检测。4 . 2 . 2 生产用种抽样: 定 植后3 0 天、 收获前两周， 在目 测的基础上， 采用随机取样法， 0 . 1 h m 2 以下检验2 点， 每点1 0 0 株 ; 0 . 1 1 - 1 h m ， 检 验 五点， 每 点1 0 0 株; 1 . 1 - 5 h m ， 检验1 0 点， 每点1 0 0 株; 超出5 h m， 面积， 划出另一检验区， 按本规程规定的面积取样。取样方法及样品保存同4 . 2 . 1 ,4 . 3 商品种薯( 苗) 抽 样 没有经过田 间检验的 种薯( 苗) 必须进行块根或种苗检验。4 . 3 . 1 根据甘薯种薯( 苗) 不同存放方式， 采用分层设点取样或随机取样， 抽样数量见表 1 , 表 1 抽样数量标准表种类种薯( 苗) 总量抽样百分率, %抽样最低数量薯苗c1 0 0 0 0 株6 - -1 01 0 0株1 0 0 0 0 株3. 5种薯簇1 o o o o k g6 - 1 0l o o k g1 0 0 0 0 k g3- 5注不足抽样最低数量的全部作为混合样品。2 将第一次抽取的样品混合后， 进行二次抽样， 随机抽取 1 0 %的混合样品检测。5 检测方法5 . 1 X点酶联免疫吸附( D o t - E L I S A ) 检测法 用于检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒， 检测方法见附录 A,5 . 2 指示植物检测法 用于辅助检测甘薯羽状斑驳病毒和甘薯潜隐病毒， 检测方法见附录 B , 检测甘薯病毒的指示植物及症状见表 2 , 表 2 检测甘薯病毒的指示植物及症状 病 毒 种 类指 示 植 物S PFM VS PLV巴西牵牛巴 西 牵 牛症状羽 状 斑 驳叶脉变黄6 质t要求 凡斑点 酶联免疫吸附检测或指示植物 检测呈阳性者为带毒薯( 苗) 。 原原种: 病毒病株允许率是。 。 原种: 病毒病株允许率-2 . 。 %。 生产用种: 病毒病株允许率(1 0 0 0 0N Y/ T 4 0 2 -2 0 0 0 附录A ( 标准的附录)斑点酶联免痊检测法A l 溶液配制 所用化学试剂为分析纯级规格， 用水为蒸馏水。Al . 1 三经甲基氨基甲烷( T B S ) ( p H7 . 5 ) T r i s B a s e 4 . 8 4 g 氯化钠( N a C I ) 5 8 . 4 4 g 叠氮钠( N a N , ) 0 . 4 0 g 溶于1 9 9 0 m L蒸馏水中， 用盐酸( 3 7 %) 调p H至7 . 5 ， 定容至2 0 0 0 m L ,A 1 . 2 洗涤缓冲液( TT B S ) 1 . 0 mL吐温一 2 0 ( T we e n - 2 0 ) 溶于 2 0 0 0 mL TB S中。Al . 3 抽提缓冲液 亚硫酸钠( N a z S O O 0 . 2 0 g 溶于T B S中. 定容至1 0 0 m L ,A 1 . 4 封闭缓冲液( 现用现配) 脱脂奶粉0 . 5 0 g 粹通 X - 1 0 0 ( T r i t o n X - 1 0 0 ) 0 . 5 m L TB S 2 5 m L 先将脱脂奶粉溶 解于少量T B S 中， 再用T B S 定容至2 5 m L 。加 人T r i t o n X - 1 0 0 混合均匀。A l . 5 抗体稀释缓冲液 脱脂奶粉1 . 0 0 g TB S 5 0 m L 先将脱脂奶粉溶 解于少量T B S中， 再用T B S 定容至5 0 m L .Al . 6 底物缓冲液( p H9 . 5 ) T r is B a s e 6 . 0 5 g 氯化钠( N a C I ) 2 . 9 2 g 氯化镁( M 9 C 1 2 6 H 2 0 ) 0 . 5 1 g 叠氮钠( N a N , ) 0 . 0 5 g 溶于4 5 0 m L蒸馏水中， 用浓盐酸调p H值至9 . 5 ， 定容至5 0 0 m L ,Al - 7 硝基蓝四哇盐( NB T) 和 5 - P A - 4 - X- 3 - 9 9 1*磷酸醋( B C I P ) 储备液 N B T储备液: NBT 0 . 0 4 g 7 0 %N, N一 二甲基甲酞胺1 . 2 m L 混合均匀， 4 C避光保存。 B C I P储备液: B CI P 0 . 0 2 g 7 0 %N, N 一 二甲基甲酞胺l . 2 m L 混合均匀， 4 C避光保存。A1 . 8 底物溶液( 现用现配) 底物缓冲液2 5 mL N Y / T 4 0 2 -2 0 0 0 N B T储备液7 5 p L B C I P储备液7 5 K L 先将 N B T储备液溶于 2 5 mL底物缓冲液中， 再逐滴加入 B C I P储备液 ， 边加边振摇混匀。A 2 样品制备 将待测叶片用清水清洗千净， 从每一样品叶片上各取一直径约1 c m圆片， 放人样品袋中， 加入3 m L 抽提缓冲液充分研磨. 4 静置 3 0 - 4 0 mi n ， 取澄清汁液点样。 样品为块根时催芽处理后取幼芽、 叶制样。A 3 操作步骤A 3 . ， 点样: 将打好方格的硝化纤维素膜用T B S 缓冲液处理后放在洁净的滤纸上， 每个样品各吸取1 7 f t L 上清液滴在膜上方格的正中， 干 燥 1 5 3 0 m i n 。 同时设阳 性、 阴性和空白 对照， 可根据需要设置重复。A 3 . 2 封闭: 将干 燥后的膜浸泡在封闭 缓冲液中， 室温下 摇床振荡( 5 0 r / m in ) 1 h ,A 3 . 3 孵育第一抗体: 将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗血清中， 室温下摇床振荡( 5 0 r / m i n )过夜。A 3 . 4 洗涤: 用洗涤缓冲液洗膜 3 次， 每次摇床振荡( 1 0 0 r / mi n ) 3 m i n .A 3 . 5 孵育第二抗体: 将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中， 室温下摇床振荡( 5 0 r / mi n ) 1 h,A 3 . 6 洗涤: 洗涤4 次， 方法同A 3 . 4 .A 3 . 7 显色: 将膜置于N B T / B C I P 底物溶液中， 室温下摇床振荡( 5 0 r / m i n ) 孵育3 0 m i n .A 3 . 8 终止反应: 弃去底物溶液并用燕馏水洗膜3 次， 每次摇床振荡( 1 0 0 r / m i n ) 3 m i n .A 3 . 9 阳性判断: 晾干后观察颜色反应， 出现蓝紫色颜色反应的样品为阳性。N Y / T 4 0 2 -2 0 0 0 附录B ( 标准的附录)指示植物检测法B 1 录育指 示植物 在防虫条件下盆栽巴西牵牛， 至 1 -2片真叶时嫁接。B 2 嫁