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药学学报ActaPharmaceuticaSinica201449(10):147914821479新药发现与研究实例简析新药创制是复杂的智力活动涉及科学研究、技术创造、产品开发和医疗效果等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹而构建化学结构是最重要的环节因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。本栏目以药物化学视角对有代表性的药物的成功构建加以剖析和解读。索非布韦是以病毒的聚合酶为靶标的第一个治疗慢性丙肝的药物2013年上市被业界认为是重磅性的突破。丙肝病毒的复制需要NS5BRNA聚合酶的参与核苷抑制剂须经三磷酸化成活化形式起效。由于一磷酸化是慢速步骤往往在核苷分子中预构成一磷酸核苷这又带来了药代和吸收的问题。构建索非布韦化学结构彰显了处理体外与体内、原药与前药、前药的稳定性和靶向性的技巧。(编者按)基于代谢活化设计的索非布韦郭宗儒(中国医学科学院药物研究所北京100050)1NS5BRNA聚合酶及核苷类抑制剂的作用机制丙肝病毒(HCV)为正链RNA病毒含有9.6kb基因编码10个蛋白:3个结构性蛋白、7个非结构性蛋白。非结构性蛋白常常作为治疗HCV药物的靶标例如其中称作NS3的丝氨酸蛋白酶对于病毒蛋白的成熟和病毒颗粒的复制起主要作用以NS3蛋白酶为靶标的抑制剂如波西匹韦等药物已用于临床治疗HCV。另一个非结构性蛋白是NS5BRNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)负责HCV的RNA链的复制在病毒基因复制、丙肝病毒在宿主细胞中的增殖是绝对必需的因而也是治疗HCV的药物靶标。索非布韦是针对丙肝病毒NS5BRNA聚合酶上市的第一个药物。以病毒聚合酶为靶标的核苷类抑制剂都需要在感染细胞内经三磷酸化作用生成活化形式而起效即相继经核苷激酶、磷酸核苷激酶和二磷酸核苷激酶催化生成三磷酸核苷而抑制聚合酶导致基因的致死合成。所以核苷类药物需要经过体内的活化。2研制HCV聚合酶抑制剂的目标Pharmasset公司研制的索非布韦是全球第一个上市的HCV聚合酶核苷类抑制剂。在此之前许多公司研究了多种核苷类化合物包括有不同的碱基、取代的(脱氧)核糖、核糖上磷酸基的预构、以及氨基酸修饰的前药等虽然没有成功但积累的知识和揭示出的问题为Pharmasset提供了研发的线索和目标:药效学上应对多种表型的HCV(特别是1型)的聚合酶具有选择性作用在安全性上对宿主细胞的聚合酶不产生抑制活性药代动力学上可以口服吸收具有化学和代谢稳定性等。3母核核苷的确定文献报道化合物2-氟代脱氧胞苷(1)体外对HCV复制子具有抑制活性EC90=6.0molL1虽然没有腺病毒作用但在EC90浓度下可诱导正常细胞进入静止期。另一化合物2-甲基胞苷(2)也具有抑制活性EC90=19.0molL1但选择性抑制作用较低例如对小鼠腹泻病毒(BVDV)的EC90=2.30molL1。基于这两个有初步活性的化合物结构Pharmasset公司设计合成了2-氟-2-甲基脱氧胞苷(3PSI-6130)离体试验表明对HCV的活性EC90=5.40molL1对非靶标BVDV的EC90100molL1而且未见细胞毒作用说明3的体外活性强度和选择性都明显提高。然而3是胞苷类核苷在体内容易被胞苷脱氨酶催化脱氨转变为尿苷而失去活性例如脱氨产物2-氟-2-甲基脱氧尿苷(4)既没有抑制HCV活性也没有细胞毒作用(ClarkJLetal.JMedChem200548:55045508)。4肝细胞代谢活化和代谢失活研究肝细胞对化合物的作用预测在体内的转1480药学学报ActaPharmaceuticaSinica201449(10):14791482化命运对进一步优化结构和完善成药性起了重要作用。将3H标记的化合物3与人肝细胞温孵在不同时间点检测肝细胞中化合物的命运发现化合物3的5位羟基发生一磷酸、二磷酸和三磷酸化产物。同时也发生脱氨作用生成化合物4(PSI-6026)以及4的一磷酸、二磷酸和三磷酸化产物(MaHetal.JBiolChem2007282:2981229820)。图1是化合物3在肝细胞中代谢过程的示意图。3经脱氧胞苷激酶(dCK)催化生成一磷酸胞苷继之可被胞(尿)苷一磷酸激酶(YMPK)催化生成二磷酸胞苷再经核苷二磷酸激酶(NDPK)生成活化形式的三磷酸胞苷后者对NS5B产生抑制作用。3也可被肝细胞中胞苷脱氨酶氧化脱氨生成尿苷4后者不能被dCK磷酸化提示胞苷脱氨是个失活过程。所以碱基为胞嘧啶的核苷类药物具有代谢不稳定性。然而一磷酸胞苷类似物经脱氨生成的一磷酸尿苷(5)在肝细胞内可发生二和三磷酸化生成的三磷酸尿苷(6)具有较高的抑酶活性Ki=0.42molL1而且5可在肝细胞中长时间存留半衰期t12=38h这些性质成为研发一磷酸尿苷类药物的重要依据(MurakamiEetal.AntimicrobAgentsChemother200852:458464)。化合物3的代谢研究提供的设计策略是以5为研发对象因为它避免了胞苷的脱氨作用也预构了一磷酸尿苷骨架为生成活化产物6提供了磷酸基的“接口”。不过化合物5的磷酸基还存在两个酸根极性强不利于过膜吸收药效和药代发生了冲突需要制成前药掩蔽极性基团加以解决(SofiaMJetal.JMedChem201053:72027218)。5借鉴:核苷酯化成前药以改善药代的先例化合物3的药代性质必须改善。为此将化合物3的3-羟基和5-羟基都用异丁酸酯化称作mericitabine(7RG-7128)是Pharmasset转给罗氏公司的候选药物。由于降低了分子的极性提高了过膜和吸收性吸收后经首过效应水解出原药提高了生物利用度。化合物7经临床试验每日口服两次每次1g治疗1型丙肝患者14天后可降低HCV的RNA水平2.7个对数单位。此外7治疗2和3型HCV患者也呈现疗效。另一个胞嘧啶核苷类HCV聚合酶抑制剂valopicitabine(8NM-283)是用缬氨酸酯化3-羟基的前药也因降低了分子极性提高口服生物利用度改善药代动力学性质(PierraCetal.JMedChem200649:66146620)。6多代谢位点前药的设计然而以5-一磷酸-D-脱氧-2-氟-2-C-甲基尿图1化合物3在肝细胞中的代谢失活和活化。dCK代表脱氧胞苷激酶YMPK代表胞(尿)苷一磷酸激酶NDPK代表核苷二磷酸激酶郭宗儒:基于代谢活化设计的索非布韦1481苷(5)为核心药物(原药)设计前药要比上述复杂的多是因为磷酸基上有两个需要修饰的酸基这是进行两次磷酸化的预留端口但磷酸基的极性又有碍于过膜吸收对这个矛盾所实行的“分子手术”是暂时地掩蔽两个酸性基团。为此利用了核苷酸结合蛋白的特异性水解功能达到前药选择性作用的目的。6.1利用核苷酸结合蛋白水解磷酰胺键的特性核苷酸结合蛋白是由HINT1编码的具有多功能的蛋白结构中含有保守的组氨酸三元体结构域His-aa-His-aa-His-aa-aa(aa代表疏水性氨基酸残基)具有水解核苷酸磷酰胺键的特性例如可将AMP-Lys或AMP-Ala水解成AMP和对应的氨基酸。由于HINT1主要分布在肝、肾和中枢神经系统而且药物经口服用药在胃肠道吸收后首先进入肝脏因此可设计含有磷酰胺片段的前药首先在肝脏中代谢活化成为作用于肝靶向的治疗药(PerronePetal.JMedChem200750:5546354)。化合物5的前药修饰利用该组织和生化的靶向特征经酰胺键和酯键连接不同的基团或片段组合成掩蔽性基团以耐受消化道的化学环境并且对血浆中酯酶和酰胺酶具有稳定性。而一旦进入肝细胞经肝脏的首过效应被上述蛋白迅速裂解掉磷酰胺键和酯键连接的基团复原成化合物5而且在肝细胞内“就地”发生两次磷酸化生成活性的三磷酸尿苷6。文献也曾报道过磷酰胺酸酯的前药设计具有能够促进前药在肝细胞内释放、提高抗病毒效力的能力(McGuiganCetal.BioorgMedChemLett200919:42504254GardelliCetal.JMedChem200952:53945407)。据此设计了结构模式为9的化合物类型。前药结构9的分子中含有3个可变动基团:R1代表与磷酸形成的酯基是在肝细胞中的离去基团生成的醇或酚应有较低肝毒性R2代表氨基酸的不同侧链其性质应在进入肝脏前该磷酰胺键稳定进入肝脏后被水解断裂R3代表氨基酸酯化的基团也是调节分子的稳定性和可逆性转变的基团。在优化过程中通过R1R3的广泛变换和组合实现在肝细胞中抗HCV效力的最大化。6.2磷酸酯R1的变换将R2和R3固定为较小基团CH3变换R1为苯环、取代的苯环(如卤代苯)、萘环或烷基离体方法评价化合物对NS5B聚合酶的抑制活性EC90和在50molL1浓度下抑制正常细胞rRNA的复制作用(%抑制率)。结果表明未被取代的苯酯是优良的基团(EC90=0.91molL1细胞毒作用=0)。6.3氨基酸侧链R2的变换将R1和R3分别固定为苯基和甲基变换R2为常见的天然氨基酸侧链如H(甘氨酸)、异丙基(缬氨酸)、异丁基(亮氨酸)、甲硫乙基(甲硫氨酸)、苄基(苯丙氨酸)等评价化合物的活性和毒性。结果表明S构型的甲基为最佳基团(即天然的丙氨酸)EC90=0.91molL1细胞毒作用=0。6.4羧酸酯基R3的变换将R2固定为甲基变换R1为苯基、4-氟或4-氯苯基R3为甲基、乙基、异丙基和环己基考察磷酸酯基不同的取代苯基与氨基酸上不同的烷酯基酯键的组配对活性和安全性的影响结果表明当R3为异丙基或甲基、R1为无取代的或卤素取代苯基等7个化合物有较优良的选择性活性。6.5体外稳定性和释放原药速率的比较前药的成药性要求口服后在胃和肠道是稳定不变的吸收到血液中也以不变的前药形式转运也就是说在胃肠道和血液中前药的化学性质和和代谢性质应是稳定的。当进入肝脏后应能够迅速裂解掉羧酸酯基、磷酸酯的(取代的)苯基、以及经磷酰胺连接的丙氨酸游离出5-磷酸-D-脱氧-2-氟-2-C-甲基尿苷(5)。后者在肝细胞中“就地”形成三磷酸尿苷抑制HCV的聚合酶。通过对7个高选择性的化合物在胃液、肠液和血浆中存留水平的测定表明它们是稳定存在的半衰期t1215h当在人肝S9组分中则迅速裂解出化合物5。这7个受试物中化合物1012的体外活性、在非靶组织的稳定性和在肝细胞生成化合物5的速率等表现优良下一步是通过体内评价这3个化合物以优选出候选药物。1482药学学报ActaPharmaceuticaSinica201449(10):147914826.6体内测定三磷酸尿苷浓度以预测抗HCV活性为实现前药对HCV患者的疗效应在人体内满足如下要求:口服吸收耐受胃酸胃液在胃中稳定耐受肠液在肠道中稳定在血液中稳定在肝细胞内迅速裂解掉前药的修饰基团暴露出化合物5化合物5在肝细胞中迅速而尽可能多地生成三磷酸尿苷6。化合物1012最后形成的活化结构虽然相同但因修饰成前药的结构不同使得药代行为(例如吸收速率和吸收量、进入肝细胞的速率和药量、转化成活性形式的速率和水平等)存在差异因而只靠体外的数据不能预判体内的效果。Pharmasset公司通过灌胃一定剂量的受试物给大鼠、犬和猴动态测定血浆中前药的Cmax和AUC用LCMSMS测定处死动物后肝脏中的前药和三磷酸尿苷6的总量(6的含量是抗HCV病毒活性的指标)。结果表明化合物12在3种实验动物释放和转化成活性产物最多应是治疗效果最佳的前药。表1列出了化合物1012给猴灌胃后血浆和肝脏的药代参数表明化合物12的血浆和肝脏药代参数明显优于另外两个(SofiaMJetal.JMedChem201053:72027218)。在安全性方面用体外微粒体和骨髓细胞实验表明化合物10和12高剂量下未呈现毒性。遂确定化合物12为候选药物命名为索非布韦(sofosbuvir)Phaemasset和Gilead公司合作进