中和实验方法.doc

RSV特异性中和抗体滴度检测一、实验原理：抗体与相应的病毒粒子特异地结合，使后者失去对易感动物或细胞的致病力。（该试验方法以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液。）二、实验分类：1. 固定血清-稀释病毒中和试验2. 固定病毒稀释血清中和试验3. 简单定性中和试验4. 空斑减少法三、实验步骤：1. 提前设定56 水浴锅，将分装好的待测血清于56 灭活（降低补体对实验结果的影响）30min 。2. 将加过双抗的培养基DMEM/F-12（用于Hep-2细胞；Vero细胞常用DMEM培养基）和BI血清进行37预热30min，与此同时灭好实验台（该准备3599细胞培养板灭过菌枪头以及15ml和50ml摇菌管）为后续实验做准备。3. 实验台灭菌30min，灭好台子后进行实验，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培养基8倍稀释待测血清（每管中加培养基210l，再加相应的血清30l），拆开96孔培养板后在盖子进行设计（实验设计参考图1），最后向每孔中加入75l的培养基，按照实验设计加入相应的稀释血清75l，用排枪以两倍梯度稀释血清。（注意：最终到256倍时吸出的多余的75l血清并弃掉。）4. 实验孔以及阳性对照孔分别每孔加入25 l（注意：加毒时应从血清低浓度到高浓度）的104 TCID50 病毒混匀，4孵育2 h。5. 在实验剩余半小时左右进行消化细胞，镜检细胞汇合度为90%左右即可用，弃掉培养液后，用2-3 ml无血清培养吹洗几遍细胞（意图为去除死细胞或活性不好的细胞），加入2 ml 胰酶后开始计时，将细胞培养板置于37的CO2无菌培养箱培养消化2-3min，在镜检细胞间有间隙或细胞收缩为单个状态为好，加入等体积的无血清培养基终止，小心吸掉液体，加入有血清的培养基2-3ml轻轻地吹下皿底部的细胞，轻微用枪吹吸几次使其成为均匀的单细胞悬液后转移到新的15ml离心管中等待细胞计数。经过计数和相应的稀释后使得细胞浓度为105个/ml 。最后加入104个Hep-2细胞（或1.5*104个Vreo 细胞）100 l，将细胞铺好后于37 的 CO2无菌培养箱培养。注意：使用细胞一般为5代以内，培养的细胞汇合度为90%左右即可用。6. 培养72 h后弃掉培养基，用PBST洗板3次，然后加入80 % 丙酮-PBS溶液（v/v）在4 冰箱固定15 min ，将孔内的液体弃掉，室温干燥。7. 加入质量体积比为5% BSA（或5 %脱脂奶粉）封闭，37放置2h，弃掉废液后用PBST洗板3次，用力拍板数次使得孔内无水珠。8. 使用2 %BSA（或2 % 脱脂奶粉）将山羊抗RSV 的多克隆抗血清稀释4000倍，加入每孔100 l后37 放置1h，PBST洗板5次，用力拍板数次使得孔内无水珠。9. 使用2 %BSA（或2 %脱脂奶粉）将HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗山羊IgG的多克隆抗血清稀释4000倍，加入每孔100 l后37 放置1h，PBST洗板6次，再次用力拍板数次使得孔内无水珠。10. 每孔加入100 l TMB显色液，于37 显色5 min。每孔加入100l 的2 moL/L的硫酸终止液，于OD450/620nm测定每孔的光密度值。中和抗体滴度的判断以低于阳性的50 % 光密度值为依据。试剂的配方：PBST的配方： 0.05% Tween20溶于PBS（PH=7.4左右），TMB显色液配方：100l的TMB（10mg/ml）；4.4ml的磷酸氢二钠溶液（0.2M）5.6ml 的柠檬酸溶液（0.1M，用1M NaOH调节到PH=5）1l 30% 的过氧化氢溶液注意： 实验中所用的细胞代数，和培养细胞的汇合度都得统一，感染复数MOI （平均每个细胞侵染病毒的个数）为1：1左右，TCID50含义：将该病毒稀释106.5接种100l可使50%的细胞发生病变。 PFU:（Plaque forming unit）空斑形成单位，感染性滴度的单位一般为PFU/ml。MOI:（Multiplicity of infection）感染复数；传统的感念起源于噬菌体感染细菌的研究，含义为感染时噬菌体与细菌的数量比值