微生物的生长与环境条件.ppt

第四章 微生物的生长与环境条件,微生物的生长与环境条件,一、微生物生长测定 二、微生物的生长规律 三、微生物的培养 四、微生物生长的环境条件 五、消毒与灭菌,第一节、微生物生长测定,一、测定单细胞微生物数量 （一）总菌数测定法 1.计数板测定法 2.比浊法 (二)活菌数测定法 1.平板菌落计数法 2.液体稀释测定法 3.膜过滤计数法,1.干重法 2.蛋白质含量测定法 3.其他生理指标测定法,(一) 微生物数量的测定 1、显微镜直接计数法 使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。 优点：操作简便，计数直观。,一、微生物生长量的测定,(一) 微生物数量的测定 2、稀释平板计数法 对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。 优点：传统计数方法。对设备要求不高。,一、微生物生长量的测定,10-3,10-5,10-4,10-6,(一) 微生物数量的测定 、比浊计数法 根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。 优点：简便，直接。,一、微生物生长量的测定,(二) 微生物重量的测定 1、称重法 用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净，称湿重或干重。 优 点：简单可靠。,一、微生物生长量的测定,第二节 微生物纯培养群体生长规律,在活性污泥法中采用的指标： （1）混合液悬浮固体(MLSS)（粗放测定） 污泥干燥-称重(W1) （2）挥发性悬浮固体(MLVSS)（相对准确） 上述已称重污泥-马福炉(500度2小时)-冷却-称重(W2),(二) 微生物重量的测定 2、蛋白质含量测定法 根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。,一、微生物生长量的测定,原理：（1）微生物蛋白质含量稳定 （2）氮是蛋白质的稳定成分 (蛋白质量=6.25总含N量),优点：测定准确。,微生物的生长规律,一、无分支单细胞微生物的群体生长规律 （一）生长曲线 1.延滞期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期 （二）生长曲线对发酵生产的指导意义（略）,根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段：,第二节 微生物纯培养群体生长规律,缓慢期 对数期 稳定期 衰亡期,二、细菌分批培养群体生长规律,第二节 微生物纯培养群体生长规律,缓慢期（延迟期、滞留适应期）,滞留适应期,二、细菌分批培养群体生长规律,特 点：分裂迟缓、代谢活跃。,产生原因：,（2） 细胞分裂必需因子的缺乏,（1）接种时的机械损伤引,第二节 微生物纯培养群体生长规律,缓慢期（延迟期、滞留适应期）,4、菌株的遗传性,滞留适应期,二、细菌分批培养群体生长规律,研究滞留适期长短的意义？,影响滞留适应期长短的因素,1、培养基成分,2、接种物菌龄,3、接种量,第二节 微生物纯培养群体生长规律,对数期（指数生长期）,特点： （1）代谢活性强 （2）世代时短而稳定,对数生长期,二、细菌分批培养群体生长规律,第二节 微生物纯培养群体生长规律,对数期（指数生长期）,对数生长期,二、细菌分批培养群体生长规律,见教材P93,Nt=2n N0 n=3.33(lgNt-lgN0) G=t/n=0.301t/(lgNt-lgN0) n繁殖代数 G世代时(每繁殖一代所需的时间) N0对数生长期开始微生物数量 Nt对数生长期经过时间t后微生物数量,第二节 微生物纯培养群体生长规律,稳定期（最高生长量期）,最高生长量期,特 点： 1、细菌数量增加率为0。 2、部分细菌大量积累代谢产物。,细菌数量增加率为0的原因?,二、细菌分批培养群体生长规律,第二节 微生物纯培养群体生长规律,衰亡期,特 点：菌体活性降低、大量死亡； 细胞畸变、自溶 革兰氏染色不稳定,衰亡期,二、细菌分批培养群体生长规律,第三节 微生物纯培养,一、微生物纯培养的概念,实验室条件下， 由一个微生物细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。,第三节 微生物纯培养,二、微生物纯培养技术,纯培养基本步骤：,(2) 培 养,(1) 分 离,第三节 微生物纯培养,二、微生物纯培养技术,1、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。 基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程,涂布,倾注,梯 度 稀 释 过 程,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,第三节 微生物纯培养,二、微生物纯培养技术,4) 操作要点： 无菌操作,稀释平板分离法使用过程中的几个问题,1) 梯度稀释度的确定： 需分离微生物在样品中的数量,2) 选择菌落接种的依据： a、菌落特征； b、菌体的特征,3) 微生物纯培养的标准： 菌落特征一致性,2、单细胞挑取法： 从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。,第三节 微生物纯培养,二、微生物纯培养技术,3、平皿划线法 (P图-) 用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。,第三节 微生物纯培养,二、微生物纯培养技术,第三节 微生物纯培养,三、目标微生物纯培养筛选的基本思路,、待分离样品的确定,、培养基的选择,、纯化过程环境条件的控制 （温度、空气、P、抑制剂）,（）,（一）纯培养的保存 试管斜面培养基低温、干燥、隔绝空气,第三节 微生物纯培养,四、纯培养的保存与复壮,1、灭菌彻底 2、棉塞大小要合适 3、无菌操作,保存过程的注意点：防止杂菌污染。,（二）纯培养的衰退与复壮,第三节 微生物纯培养,四、纯培养的保存与复壮,第四节 微生物的生活环境,极端环境条件对微生物的影响 死 亡,第四节 微生物的生活环境,一、温度,1、温度对微生物生长的影响,第四节 微生物的生活环境,2、高温灭菌,一、温度,高温灭菌,湿热灭菌,干热灭菌：干燥条件，160维持1-2h。,高压蒸汽灭菌法：密闭条件下，水加热蒸发形成高压 的同时产生高温。利用高温杀死菌。,巴斯德消毒法：采用60-70的温度处理15-30min 的消毒方法。,第四节 微生物的生活环境,3、低温保藏,一、温度,菌种保存（试管斜面或孢子砂土管）,食品保藏,特例：流感杆菌、脑膜炎球菌,第四节 微生物的生活环境,二、氧气p94,专性好氧菌 Eh0.1V，而以0.3-0.4v为宜 兼性厌氧菌 Eh0.1v行好气呼吸 厌氧菌 Eh值0.1V以下 耐氧菌 微好氧菌,专性好氧菌（strict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能,兼性好氧菌（facultative aerobe）,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,第四节 微生物的生活环境,三、水分,1、水分对微生物生长的影响： 细菌最适水的活度值：0.93-0.99 酵母菌最适水的活度值：0.88-0.91 霉菌最适水的活度值： 0.80,2、应用：干燥法保存物品 食品的冷冻干燥,水的活度小于0.60-0.70时 休眠、部分出现细胞脱水、蛋白质变性(多数微生物),第四节 微生物的生活环境,三、辐 射,辐射：能量通过空间传递的一种物理现象。,1、可见光：（400nm800nm） 对微生物的作用：,光氧化作用：有氧条件下，光线被细胞内色素吸收，使酶或其它敏感成分失活引起的微生物死亡。,（3）光氧化作用。,（1）能源,（2）刺激担子菌子实体形成,2、紫外线： 杀菌波长范围：240300nm 杀菌力最强范围： 255265nm,三、辐 射,紫外线杀菌特点： 穿透力弱，用作表面消毒或空气灭菌,第四节 微生物的生活环境,3、电离辐射,第四节 微生物的生活环境,三、辐 射,高能电磁波照射后发生的电离作用。,电离辐射对微生物的作用：,粮食、果蔬、畜禽产品、饮料以及卫生材料杀菌处理,低剂量(500伦琴)：促进生长、诱发变异,高剂量（10万伦琴）：杀菌作用,实际应用：,（X射线、射线等）,第四节 微生物的生活环境,四、化学药物,1、重金属盐类,杀菌机理：,杀菌机理： 与带阴电荷的菌体蛋白质结合使其变性 （Hg、Ag盐，与细菌酶蛋白的巯基结合）,2、有机化合物（酚、醇、醛）,蛋白质变性,损伤细胞壁和膜,抑制酶系统(脱氢酶、氧化酶等)；,第四节 微生物的生活环境,四、化学药物,杀菌机理： 漂白粉Ca(OCl)2及氯气 ：产生次氯酸盐和原子氧； 碘：与酶分子中的酪氨酸结合。,3、氧化剂（高锰酸钾、过氧化氢、过氧乙酸）,4、卤素（Cl、I常见）,具有降低表面张力效应的物质。,第四节 微生物的生活环境,四、化学药物,直接干扰病原微生物的生长繁殖并用于治疗感染性疾病的化学药物。 （选择性的杀菌或抑菌）,5、表面活性剂（新洁尔灭、消毒宁等）,杀菌机理：影响细胞生长、分裂,6、化学治疗剂,抑制叶酸合成 如：磺胺类药物等。,杀菌机理：,抑制蛋白质合成 如：链霉素，红霉素、四环素、氯霉素等,抑制肽聚糖合成 如：青霉素，万古霉素等。,第五节：消毒与灭菌,几个基本概念,灭菌（sterilization） 采用强烈的礼花因素是任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。 消毒（disinfection） 采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。 防腐（antisepsis） 利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。 化疗（chemotheraphy） 即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。,1、高温灭菌（消毒）法是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,一、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法,（一）温度,干热灭菌法（dry heat sterilization） 焚烧法（incineration）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。 干燥热空气灭菌法(hot-air oven)：将物品放入烘箱内，然后升温至150170 ，维持12小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。,湿热法(moist heat sterilization) ： 特点：温度低、时间短、灭菌效果高 原因： 1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力强； 4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。,高压蒸汽灭菌法 利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 以上高温灭菌的方法。 方法：121（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min。 112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。 115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。 应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度 例如：生理盐水、营养琼脂等培养基用121 。 含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 。 适用：耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。,高 压 蒸 汽 灭 菌 锅,注意事项： 排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,消毒p100,煮沸消毒法 将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。 巴斯德消毒法（Pasteurization）： 用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒 该法一般是将待消毒的液体食品置于62处理30min，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。 低温长时法(Low temperature long time,LTLT)；62.930min处理牛奶 高温瞬时法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.615s处理牛奶 超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):让液体食品停留在140左右3-4s，急剧冷却至75，经匀质化后冷却至20。,间歇灭菌法： 将待灭菌物品在80-100蒸煮15-60min，冷却后搁置室温（28-37）下过夜，并重复以上过程三遍以上。 其蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽胞，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。 适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。 缺点是麻烦、费时。,二、常用的控菌方法,消毒剂:可以抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用