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-内酰胺酶研究进展 -内酰胺酶研究进展摘要：青霉素于40年代初首次用于临床，几年后就从链球菌中分离到了青霉素酶，以后随着-内酰胺类抗生素的不断开发和广泛应用，特别是近几十年来超广谱新品种的大量应用，-内酰胺酶的种类、底物谱和耐药程度均以惊人的速度在发展，不能不引起格外的重视。关键词：细菌，-内酰胺酶，耐药任何生物都试图适应周围环境并生存下去，细菌个体小，易变异,拥有耐药能力，这是自然界的法则。科学界有一种理论叫“中性突变漂变学说”，以“中性突变”为基础的分子进化学已逐渐形成。这个学说认为，在分子水平上看，大部分基因突变对于生命体的生存既不产生有利效应，也不酿成不利后果，因此，这类突变在自然选择中是“中性”的。在亿万年中，生物体内的基因不断产生中性突变，他们不受自然选择的支配，而是通过随机的偶然过程（即遗传漂变）在群体中固定下来或是被淘汰，结果就造成了基因和蛋白质分子的多样性，实现了分子的进化。在药物选择性压力下，产-内酰胺酶的细菌被筛选出来，得以泛滥。为了对-内酰胺酶有一个教深入了解，现将-内酰胺酶的研究综述如下。1 -内酰胺类药物作用机理肽聚糖合成的最后一步是被称为青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，即PBPs）的转肽酶形成的。 内酰胺类抗生素与D-丙氨酰-D-丙氨酸结构上的相似使得它们与青霉素结合蛋白结合（图一）。-内酰胺核不可逆地与青霉素结合蛋白的Ser403单元结合，使其失活，从而抑制细菌细胞壁的形成。此外这个结合可能还激活细胞壁中的自溶酶。 图1 青霉素与青霉素结合蛋白结合使酶失活 2 -内酰胺酶起源-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其 N-酰基衍生物分子中-内酰胺环酰胺键的灭活酶。-内酰胺酶来源于细菌细胞壁合成酶(即PBPs)，是由于细菌合成PBPs的过程中的基因的变异而造成的（图2）。-内酰胺类药物在这类酶的作用下，使-内酰胺环水解开环，而-内酰胺环是与PBPs结合的活性功能部位，因此-内酰胺环的破坏使其失去了干扰细菌细胞壁合成的功能。 图2 PBPs突变为酶后可结合青霉素并将其破坏 3 -内酰胺酶破坏-内酰胺抗生素的作用机制-内酰胺酶破坏-内酰胺抗生素的-内酰胺环有两种作用机制。第一，绝大多数常见的-内酰胺酶有一个依赖丝氨酸发挥作用的机制，并且根据氨基酸序列组成分为三类（A，C和D）。通常它们的活性位点具有一个狭窄的纵形沟状结构，在沟的底部形成了一个空腔（氧阴离子袋），这种疏松的构造容易弯曲，便于结合底物。由于-内酰胺环上的羰基碳在结合内酰胺酶活性部位的丝氨酸时发生了不可逆的反应，结果使其成为开环物，进而重建了-内酰胺酶。这类酶对青霉素、头孢菌素、单内酰环类抗生素都有活性。第二，是一类不大多见的-内酰胺酶，被称为金属类-内酰胺酶，或B类-内酰胺酶。它们的特点是利用一个2价金属离子，绝大多数为锌离子，分别与组氨酸或半胱氨酸结合，或同时与二者结合，并与-内酰胺类抗生素的羰基碳的酰胺键相互作用，使其不能发挥作用。这类酶主要对青霉素、头孢菌素、碳青酶烯类抗生素发挥作用，但对单内酰环类抗生素无效。4 -内酰胺酶分类细菌产生-内酰胺酶是细菌对-内酰胺类抗生素耐药的主要机制。-内酰胺酶分为染色体介导酶和耐药质粒介导酶二大类，以其水解对象可分为青霉素酶、头孢菌素酶、广谱酶和超广谱酶四种。染色体介导酶有K1型，P99型及D31型，染色体基因决定细菌对抗生素固有耐药性。质粒介导的-内酰胺酶用等电聚焦法分型有TEM型(TEM-1，TEM-2)，OXA型(OXA-13)，PSE型(PSE-14)，SHV-1，HMS-1等标准酶，均为G-杆菌，主要为大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、肠杆菌属、绿脓杆菌等产生。 近代研究证明在院内感染病人中产生质粒介导酶的耐药菌，其产生耐药性大多是在接触抗生素后获得的，并通过耐药基因的转移而播散，也可由基因表达而传至下代。至今-内酰胺酶的数量已超过200种。根据Bush Jacoby-Medeiros的最新分类法l，-内酰胺酶按照各自的底物和抑制轮廓分为4组，根据各自的氨基酸序列分属于A、B、C、D共4种分子类别(表1)。 表1 -内酰胺酶分类-内酰胺酶分类组别分子类型优先选择的底物被抑制情况代表酶克拉维酸EDTA1C头孢菌素革兰氏阴性杆菌的AmpC,MIR-12aA青霉素革兰氏阳性菌的青霉素酶2bA青霉素，头孢菌素TEM-1，2，SHV-12beA青霉素，窄谱和广谱头孢菌素，单环类TEM-326，SHV-26，产酸克雷伯氏菌K12brA青霉素TEM-30362cA青霉素，羧苄西林PSE-1，3，42dD青霉素，氯唑西林OXA-111，PSE-22eA头孢菌素普通变形菌头孢菌素酶2fA青霉素，头孢菌素，碳青霉烯类阴沟肠杆菌NMC-A，粘质沙雷氏菌Sme-13B多数-内酰胺类（包括碳青霉烯类）嗜麦芽黄单胞菌L1，脆弱拟杆菌CcrA4未知青霉素？洋葱假单胞菌青霉素酶第l组是不被克拉维酸抑制的头孢菌素酶，分子量大于30kD，pI7.0，分子类别C类。大部分由染色体介导，但近年来发现也可由质粒介导25。第2组为可被克拉维酸抑制的内酰胺酶，为数量最多的一组，一半以上由质粒介导。根据对青霉素、头孢菌素、肟类-内酰胺、氯唑西林、羧苄西林和碳青霉烯类抗生索的水解活性分为2a、2b、2be、2c、2d、2e共6个亚组。最近发现的不能被克拉维酸抑制的TEM型酶和染色体介导的A类碳青霉烯酶分属于2br和2f亚组。除2d的分子类别为D类外，其余各亚组分子类别均为A类。第3组酶的作用需要金属离子如Zn2+的参与，故称为金属-内酰胺酶。分子类别属B类，不被克拉维酸抑制，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制。由于本类酶对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和-内酰胺酶抑制剂的广泛耐药性，是现代抗菌化疗中尚未突破的一个难点，也是针对细菌耐药机制研究开发新的有效抗菌药的重点之一6。第4组包括少量青霉素酶，不被克拉维酸抑制，除1种酶外，均由染色体介导。本组分子类别未知。5 -内酰胺酶基因的表达调控细菌-内酰胺酶耐药基因突变可引起广泛耐药，按突变位置不同可分为2类。第1类突变发生于结构基因上，其结果是导致新酶的产生，如近年来发展迅速的由质粒介导的TEM和SHV型超广谱酶通过结构基因上单点或多点突变衍生出大量的新型超广谱酶，造成临床治疗的困难7，此类突变涉及到内酰胺酶与-内酰胺类抗生素之间相互作用的构效关系。第2类突变发生在结构基因以外的区域，多数为启动基因或调节基因，后者的改变往往造成结构基因的过度表达，使产酶量大增而导致耐药8-9。目前一般认为这种对产酶量的基因调控模式除以上启动基因或调节基因的突变以外，还包括启动基因的插入序列增强启动能力10、多拷贝质粒11和基因复制12，它们通过不同的方式引起-内酰胺酶的大量产生。此类基因调控模式最具代表的酶为C类头孢菌素酶AmpC。C类-内酰胺酶具有很强的可诱导性，产酶株在不接触-内酰胺类抗生素时，只产生少量的酶；如有诱导作用的抗生素存在，可使酶产量显著上升，因而这种酶又称诱导酶10。分子生物学研究表明13，14，ampC是AmpC的结构基因，在AmpC的合成过程中主要有ampD、ampG和ampR 3种调控基因参与(图3)。ampR与ampC相邻地排列在染色体内，并呈异向转录。ampR编码产生1个3lkD的调 图3 AmpC酶的产生和调控机制ampD与ampG位于操纵子部位，分别编码产生AmpD和AmpG蛋白，当抗生素作用于细菌细胞壁后，在转糖酶的作用下肽聚糖长链的基本结构N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酸断键，降解为N-乙酰葡萄糖醛-N-乙酰胞壁醛三肽(T)15，在具有透性酶活性的AmpG帮助下，T作为信号肽从周质渗透人胞浆，进入胞浆的T有两条去路：第一，具有酰胺酶活性的AmpD蛋白可特异性地与T上的L-丙氨酸结合发生脱酰化反应，最终使L丙氨酰-D-谷氨酰-消旋二氨基庚二酸三肽(I)从T游离出来，I又可作为原料参与胞壁质的合成16；第二，AmpR蛋白在没有诱导剂存在时，是AmpC合成的抑制子；但在信号肽T的诱导下，则起激活子作用，激活ampC转录，合成AmpC酶10。由此可见，ampG、ampD和ampR 3种调节基因在AmpC合成的基因调控中各自发挥了不同的作用。ampD编码产生的AmpD蛋白维持T与I在数量上的平衡，即控制着ampC转录信号的强弱；当ampD基因突变，产生有缺陷的AmpD蛋白，大量的T激活AmpR，从而引起ampC过度表达，使产酶量大增引起耐药,见表2。表2 ampG、ampD和ampR 3种调节基因及其编码的蛋白质的作用调控基因编码蛋白蛋白作用ampDAmpD该蛋白具有酰胺酶活性，可特异性地与T上的L-丙氨酸结合发生脱酰化反应，最终使L丙氨酰-D-谷氨酰-消旋二氨基庚二酸三肽(I)从T游离出来，I又可作为原料参与胞壁质的合成。维持T与I在数量上的平衡，即控制着ampC转录信号的强弱ampGAmpG该蛋白具有透性酶活性，可使T作为信号肽从周质渗透人胞浆ampRAmpRAmpR蛋白在没有诱导剂存在时，是AmpC合成的抑制子；但在信号肽T的诱导下，则起激活子作用，激活ampC转录，合成AmpC酶这种因ampD基因突变导致的-内酰胺酶大量产生被称为去阻遏突变17，此种耐药机制多见于阴沟肠杆菌，在临床分离的大肠埃希氏菌中这种突变机率高达10-410-6，从而造成对第三代头孢菌素的严重耐药18。ampG基因的缺失或突变可造成T进入胞浆的困难，使T失去诱导产酶的作用，从而降低-内酰胺酶的诱导量。如果ampR基因突变，产生有缺陷的AmpR蛋白，则这种缺陷蛋白本身就丧失了调控ampC基因转录的能力，因此,不论其它调节基因是否正常，也不管诱导剂是否存在，都不能对AmpR蛋白发生影响6。某些大肠埃希氏菌和宋氏志贺氏菌仅有ampD和ampG，缺乏ampR，但却有极高的产酶力，此种现象在临床分离的大肠埃希氏菌中达18，对此，研究者认为可能是细菌通过基因的水平转化获得1个有效启动子从而激活酶的合成。如上所述，C类酶的基因突变一般发生在调节基因上，通过对产酶量的调控引起细菌耐药。另外，也有报道表明突变可发生于结构基因上，但一般认为后者编码产生的-内酰胺酶尽管在pI等性质上有变化，但其水解抗生素的动力学性质不变，因此，这种突变对于耐药性而言无实际临床意义19。最近有报道产自阴沟肠杆菌GCl的AmpC酶其结构中有一类似于TEM型酶的环结构(此结构为TFM酶突变好发区)，此酶水解头孢呋辛的速率是其原型酶P99的100倍20。尽管A类酶的突变更多地发生在结构基因上（表3），但近年来本类酶在调节基因上的突变也越来越频繁地被发现，提示各类-内酰胺酶的基因调控方式趋于多样化和复杂化。 表3 各类酶基因突变易发生的位点酶的分子类型该类酶的基因突变易发生的位点AA类酶的突变更多地发生在结构基因上，但近年来本类酶在调节基因上的突变也越来越频繁地被发现BB类金属-内酰胺酶也可通过启动基因上的多点突变产生耐药，但本类酶更多的是通过启动子区上的插入序列(IS)为转录开始提供强启动信号，从而造成-内酰胺酶的高效表达CC类酶的基因突变一般发生在调节基因上，通过对产酶量的调控起细菌耐药Fournier21,22对产酸克雷伯氏菌突变株的研究表明突变株对氨曲南的MIC较原型株大100倍，产酶量增加75倍；DNA测序分析未见结构基因有扩增和重排发生，而在基因转录起始点上游10位的pribnow盒有点突变发生，由此作者认为启动基因的点突变导致结构基因的过渡表达，引起菌株大量产酶。另外，许多产染色体介导的A类酶的菌株中发现有类似于前述C类酶中的AmpR调节蛋白，如InliR、NmcR和SmcR，它们都由位于-内酰胺酶结构基因上游的调节基因编码产生，即imiR编码产生ImiR，nmcR编码产生NmcR，smeR编码产生SmeR。但三者的结构基因与调节基因在相对位置上有所不同，其中nmcA与nncR为部分重叠基因，这被认为是一种较为经济的排列有限基因组的方式，也有较高的表达效率，可防止过多的无效表达。如前所述，AmpR在诱导剂存在时为正调控(激活子)，无诱导剂时为负调控(抑制子)；而NmcR和SmeR不管有无诱导剂存在都为正调控方式，但调节基因编码NmcR和SmeR的水平则依赖于诱导剂的存在，这一点与AmpR相同，不过，ImiR、NmcR和SmeR这些凋节蛋白都缺乏类似于SXXK、KTG、SDN的结构域单元，因此认为它们并不与-内酰胺相互作用。smcR相对较低的表达水平可能是由于调控基因中缺乏SD序列，即核糖体结合位点(RBs)，而后者对翻译水平可产生较大影响。B类金属-内酰胺酶也可通过启动基因上的多点突变产生耐药，但本类酶更多的是通过启动子区上的插入序列(IS)为转录开始提供强启动信号，从而造成-内酰胺酶的高效表达。令人惊奇的是，在含有金属-内酰胺酶基因的脆弱拟杆菌中，超过80的菌株在启动子区上都有不同的插入序列。目前已被明确的插入序列有IS942、IS1186和IS435l，其中lS942和IS1186有高效表达金属-内酰胺酶的能力，而IS4351只具有中效表达能力；此类插入序列极少存在于不含金属-内酰胺酶基因的脆弱拟杆菌中。6 结束语耐药性是一个与特殊抗生素有密切关系的问题，而且是一个不可避免的问题，也不可能毕其功于一役，所以控制细菌耐药性的策略不应该是以限制使用抗生素为首，而是要对抗生素合理应用。控制策略建议：（1）采取适当的方法来控制菌株的传播。（2）确定身体的某个部位或体液中的细菌是定制的还是真正被感染的。对定值细菌不需治疗，对感染细菌才需要使用抗生素。（3）下策才是限制使用抗生素（主要是限制使用：头孢他啶，环丙沙星，万古霉素和亚胺配能等高潜在耐药性的抗生素）。 在合理利用抗生素的同时，我们也要加快对细菌耐药的研究和新药物的开发，未雨绸缪，为更多人和动物谋福利。参考文献1 Bush KJacoby GAMedeiros AAA functional classification for -1actamases and its correlation with mo1ecular structureJAntimicrob Agents Chemother,1995，39：12112 Gonzalez LM，Perez-Dlaz JCAyala Jet alGene sequence and biochemical characterization of FOX-1 from Klebsiella pneumoniae，a new AmpC-type plasmid-mediated -lactamase with two molecular variantsJAntimicrob Agents Chemother.1994-38：2l503 Tzouvelekis LS，Tzelepi EMentis AFet a1Identification of a novel plasmid-mediated -lactamase with chromosomal cephalosporinase characteristics from Klebsiella pneumoniae.JJ Antimicrob Chemother,1993,31:6454 Tzouvelekis LSTzelepi E，Mentis AF. 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