保护碱基列表.doc

11月13日引物合成的详解1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3端向5端合成的，相邻的核苷酸通过35磷酸二酯键连接。第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5-羟基的保护基团DMT，获得游离的5-羟基。第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3端被活化，5-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5-羟基发生缩合反应。第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。2.引物纯化方式有哪些，如何选择？C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。OPC纯化： OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。3.引物的OD数如何定量？答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。4.需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。应用 引物长度要求 纯度级别要求 一般PCR扩增 45 base PAGE 诊断PCR扩增 90 90 0 90 90 AscI GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 AvaI CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 90 90 90 90 90 BamHI CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 90 90 25 90 90 BglII CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 12 0 75 25 0 90 90 BssHII GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 50 0 0 90 BstEII GGGT(A/T)ACCC 9 0 10 BstXI AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 90 ClaI CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 8 8 10 12 0 0 90 50 0 0 90 50 EcoRI GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 10 12 90 90 90 90 90 90 HaeIII GGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 HindIII CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 12 0 0 10 0 0 75 KpnI GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 12 0 90 90 0 90 90 MluI GACGCGTC CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50 NcoI CCCATGGG CATGCCATGGCATG 8 14 0 50 0 75 NdeI CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 8 10 12 18 20 22 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 90 90 NheI GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 8 10 12 0 10 10 0 25 50 NotI TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 12 16 20 24 28 0 10 10 25 25 0 10 10 90 90 NsiI TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 12 22 10 90 90 90 PacI TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 8 10 12 0 0 0 0 25 90 PmeI GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 8 10 12 24 0 0 0 75 0 25 50 90 PstI GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 8 14 22 24 26 0 10 90 90 0 0 10 90 90 0 PvuI CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 8 10 12 0 10 0 0 25 10 SacI CGAGCTCG 8 10 10 SacII GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA 8 12 0 50 0 90 SalI GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA 28 30 32 0 10 10 0 50 75 ScaI GAGTACTC AAAAGTACTTTT 8 12 10 75 25 75 SmaI CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 6 8 10 12 0 0 10 90 10 10 50 90 SpeI GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 8 10 12 14 10 10 0 0 90 90 50 50 SphI GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT 8 12 14 0 0 10 0 25 50 StuI AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT 8 10 12 90 90 90 90 90 90 XbaI CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAG