分子生物学知识点整理.doc

1、 名词解释：1. 基因：基因是位于染色体上的遗传基本单位，是负载特定遗传信息的DNA片段，编码具有生物功能的产物包括RNA和多肽链。2. 基因表达：即基因负载遗传信息转变生成具有生物学功能产物的过程，包括基因的激活、转录、翻译以及相关的加工修饰等多个步骤或过程。3. 管家基因：在一个生物个体的几乎所有组织细胞中和所有时间段都持续表达的基因，其表达水平变化很小且较少受环境变化的影响。如GAPDH、-肌动蛋白基因。4. 启动子：是指位于基因转录起始位点上游、能够与RNA聚合酶和其他转录因子结合并进而调节其下游目的基因转录起始和转录效率的一段DNA片段。5. 操纵子：是原核生物基因表达的协调控制单位，包括有结构基因、启动序列、操纵序列等。如：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等。6. 反式作用因子：指由其他基因表达产生的、能与顺式作用元件直接或间接作用而参与调节靶基因转录的蛋白因子（转录因子）。7.顺式作用元件：即位于基因附近或内部的能够调节基因自身表达的特定DNA序列。是转录因子的结合位点，通过与转录因子的结合而实现对真核基因转录的精确调控。8. Ct值：即循环阈值（cycle threshold，Ct），是指在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数。（它与PCR扩增的起始模板量存在线性对数关系，由此可以对扩增样品中的目的基因的模板量进行准确的绝对和（或）相对定量。）9. 核酸分子杂交：是指核酸分子在变性后再复性的过程中，来源不同但互不配对的核酸单链（包括DNA和DNA，DNA和RNA，RNA和RNA）相互结合形成杂合双链的特性或现象，依据此特性建立的一种对目的核酸分子进行定性和定量分析的技术则称为分子杂交技术。10. 印迹或转印：是指将核酸或蛋白质等生物大分子通过一定的方法转移并固定至尼龙膜等支持载体上的一种方法，该技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹。11. 探针：是一种用同位素或非同位素标记核酸单链，通常是人工合成的寡核苷酸片段。12. 基因芯片：又称DNA芯片或DNA微阵列，是基于核酸分子杂交原理建立的一种对DNA进行高通量、大规模、并进行分析的技术，其基本原理是将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的待测样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而对待测样品中的核酸进行定性和定量分析。13. 基因文库：是指通过克隆方法保存在适当宿主中的一群混合的DNA分子，所有这些分子中的插入片段的总和，可代表某种生物的全部基因组序列或全部的mRNA序列，因此基因文库实际上是包含某一生物体或生物组织样本的全部DNA序列的克隆群体。基因文库包括两类：基因组文库和cDNA文库。14. 克隆：是来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。15. 载体：为携带的目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。16. 限制性核酸内切酶：识别DNA的特意序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。17. 基因工程（Genetic Engineering）：又称基因操作（gene manipulation）、DNA重组（DNA recombination），是指采用类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，将一种或多种生物体（供体）的基因育载体在体外进行拼接重组构建成杂种DNA分子，然后转入另一种生物体（受体）内，以改变生物原有的遗传特性并表达出新的性状。获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素，其中相对于受体而言，来自供体的基因属于外源基因。由于DNA重组分子大都需在受体细胞中复制扩增，故还可以将基因工程表征为分子克隆（Molecular Cloning）或基因的无性繁殖。18. 目的基因：感兴趣的基因或DNA序列。19. 生长因子：（growth factor）通过质膜上特异的受体，将信息传递至细胞内部，调节细胞生长与增殖的多肽类物质。20. 基因组：泛指一个生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质。21. 蛋白质组：指一个细胞内的全套蛋白质，反映了特殊阶段、环境状态下，细胞或组织在翻译水平的蛋白质表达谱。22. 人类基因组计划：是美国科学家于1986年率先提出，1990年正式启动的，这一计划的目标是为30亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，从而最终弄清楚每种基因产生的蛋白质及其作用，它的实施将会为认识疾病的分子机制以及诊断和治疗提供重要依据。23. 基因诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对人体状态和疾病做出诊断的方法。24. 基因治疗：从广义来说，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用而达到治疗疾病目的的方法均称为基因治疗。25. 基因替换：用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内DNA完全恢复正常状态的基因治疗方法。26. 自杀基因：某些病毒或细菌的基因所表达的酶能将对人体无毒或低毒的药物在人体细胞内转变为细胞毒性产物，从而导致携带该基因的受体细胞也被杀死，故称这类基因为“自杀基因”。27. 转录组：是一个细胞内的一套RNA转录物，包含了某一环境条件下、某一生命阶段、某一生理或病理状态下，生命体的细胞或组织所表达的基因种类及水平。28. 癌基因：（oncogene）细胞内控制细胞生长和分化的基因，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变。29. 病毒癌基因：存在于肿瘤细胞中，能使靶细胞发生恶性转化的基因。30. 抑癌基因：也称为抗癌基因。抑癌基因的产物是抑制细胞增殖，促进细胞分化，和抑制细胞迁移，因此起负调控作用，抑癌基因的突变是隐性的（也称抗癌基因。抑癌基因的产物是抑制细胞增殖，促进细胞分化，和抑制细胞迁移，因此起负调控作用，抑癌基因的突变是隐性的。）31. 结构基因组学：是以全基因组测序为目标的基因结构研究，弄清楚基因组中全部基因的位置和结构，为基因功能的研究奠定基础。其主要内容就是制作高分辨率的人类基因组的遗传图和物理图，最终完成人类其他重要模式生物全部基因组DNA序列测定。2、 问答题1. 以乳糖操纵子为模型解释原核生物转录水平的调控模式 转录水平的调节操纵子调控模式 （1）操纵子的概念：操纵子是原核生物基因表达的协调控制单位，包括有结构基因、启动序列、操纵序列等。如：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等。 （2）乳糖操纵子的结构：乳糖操纵子包括调节基因I、一个操纵序列O、一个启动序列P以及单个结构基因Z、Y、A。其中调节基因I编码生成阻遏蛋白，后者与操纵序列结合；RNA聚合酶与启动序列结合；分解代谢物基因激活蛋白（CAP）也结合在操纵序列附近；结构基因Z、Y和A分别编码三个与乳糖代谢有关的酶，即：-半乳糖苷酶，透酶和乙酰转移酶。这三个酶的基因作为一个整体由同一个调控区调节，以实现基因的协调表达。 （3）其调节机制主要有正性和负性两种模式。阻遏蛋白的负性调节：当没有乳糖时，调节基因表达生成阻遏蛋白，阻遏蛋白结合操纵子序列出，阻碍RNA结合酶与启动序列结合，抑制结构基因的转录启动，此时操纵子处于阻遏状态；当有半乳糖存在时，乳糖首先被转变成半乳糖，半乳糖则作为一种诱导剂与阻遏蛋白结合，诱发蛋白质构象改变，使阻遏蛋白从启动序列上解离下来，从而启动结构基因的转录，此时操纵子处于诱导状态。CAP的正性调节：当没有葡萄糖时，cAMP浓度升高，与CAP结合，CAP进而结合在启动序列附近，从而进一步促进结构基因的转录。当有葡萄糖时，cAMP浓度降低，结合在启动序列附近的CAP减少，结构基因转录速率降低。协调调节：实际情况下，上述两种调节方式是相辅相成、相互协调的。譬如：在无乳糖且有葡萄糖时，阻遏蛋白负性调节起作用，此时结构基因不被转录；在有乳糖且有葡萄糖时，阻遏蛋白负性调节不起作用，此时结构基因转录水平低；在有乳糖且无葡萄糖时，阻遏蛋白的抑制作用不解除，CAP正性调节被激活，此时结构基因的转录水平最高。2. 生长因子的作用机制生长因子由不同的细胞的细胞合成后分泌，作用于靶细胞上的相应受体，这些受体有的是位于细胞膜上的，有的是位于细胞内部。生长因子与受体结合后，激活细胞内信号传递体系，产生相应的生物学作用。根据受体的分布和对生长因子不同的响应，生长因子是作用机制分为三种情况：生长因子与具有酪氨酸蛋白激酶（TPK）活性的跨膜受体结合，TPK被活化，磷酸化相应蛋白质，产生生理效应。与膜上受体结合，通过胞内信息传递，产生第二信使，是蛋白激酶活化，再磷酸化相应的效应蛋白质，这些被磷酸化的蛋白质再活化核内的转录因子，引发基因转录，达到调节生长与分化的作用。与膜内受体结合，形成生长因子-受体复合物，进入胞核活化相关基因，促进细胞生长。与胞内受体结合 与膜受体结合激活胞核相关基因 生长因子-受体复合物基因转录核内转录因子活化活化蛋白激酶磷酸化相应蛋白质产生第二信使活化酪氨酸激酶生长因子作用机制示意图3. 常规PCR技术的基本原理基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。变性（denature）：模板DNA经加热至95左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。退火（annealing）（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，将温度降至引物的Tm值左右或以下（55左右），引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，形成杂交链。延伸（extension）：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 以上三步为一个循环，约需24分钟，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，大约23小时后，新生DNA片段理论上可达到2n-1个分子拷贝。4. 定量PCR技术的基本原理基本原理：将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时检测PCR反应进行的情况，PCR反应管内的荧光信号强度达到设定阈值所经历的循环数（即Ct值）与扩增的起始模板量进行准确的绝对和（或）相对定量。循环阈值（cycle threshold，Ct）是指在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数。荧光阈值（threshold）一般是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。实际上就是荧光信号开始由本底信号进入指数增长阶段的拐点时的荧光信号强度。5. Sanger测序法的基本原理 Sanger法也称双脱氧链末端终止法，是目前应用最为广泛的方法。 基本原理：它巧妙地利用了DNA复制的原理，是利用ddNTP来代替常规的dNTP作为底物进行DNA合成反应。在DNA合成时，一旦ddNTP参入到合成的DNA链中，由于ddNTP脱氧核糖的3-位碳原子上缺少羟基而不能与下一位核苷酸的5-位磷酸基之间形成3,5-磷酸二酯键，从而使得正在延伸的DNA链在此ddNTP处终止。6. Southern印迹、Northern印迹的异同相同点：基本流程相似不同点：Southern 印迹（杂交）Northern 印迹（杂交）用途主要用于检测基因组DNA主要用于检测RNA事先进行限制性内切酶处理需要不需要，可直接电泳进行碱变性需要不需要，采而是用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳7. 基因工程中如何选择载体？基因工程选择载体的标准如下：能自主复制具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点分子量小，以容纳较大的外源DNA8. 重组DNA技术的基本步骤？重组DNA技术的基本操作过程可形象的归纳为“分、切、接、转、筛”，即“目的基因的获取克隆载体的选择和构建外源基因与载体的连接DNA导入受体细胞重组体的筛选克隆基因的表达”。分述如下：目的基因的获取。可通过化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、PCR等方法获取。克隆载体的选择和构建。根据实验目的和操作基因的性质选择合适的载体和改建方法。外源基因与载体的连接。将外援DNA通过DNA连接酶进行共价连接。DNA导入受体细胞。重组DNA分子导入相应宿主细胞后，随受体细胞生长、增殖而得以复制、扩增。重组体的筛选根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况，采取直接选择法和非直接选择法进行筛选，获得含有重组DNA分子的克隆。克隆基因的表达。克隆的目的基因如果需要正确而大量表达有特殊意义的蛋白质，则需要建立相应的表达体系，包括表达载体的构建、受体细胞的建立及表达产物的分离、纯化等。9. 目前基因治疗采用的方法分为哪几种？基因治疗的方法分为以下：基因矫正，将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留的基因治疗方法；基因置换，用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内DNA完全恢复正常状态的基因治疗方法；基因增补，将目的基因导入病变或其他细胞，不去除异常基因，通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得以加强的基因治疗方法；基因失活，将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达的治疗方法；自杀基因的应用，用某些病毒或细菌的基因所表达的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体在人体细胞内转变为细胞毒性产物，从而导致携带该基因的受体细胞也被杀死，故称这类基因为“自杀基因”。10. 基因治疗的基本过程？基因治疗的基本过程包括：治疗性基因的选择，选择对疾病有治疗作用的特定目的基因是基因治疗的首要问题；基因载体的选择，目前使用的载体分病毒性载体和非病毒性载体两类，而一般临床多选用病毒性载体。目前被用作基因转移的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒；靶细胞的选择，根据受体细胞的不同，基因治疗可分为体细胞的基因治疗和生殖细胞的基因治疗，而目前基因治疗禁止使用生殖细胞，仅限于使用体细胞为靶细胞。基因转移，如何有效地将外源基因导入受体细胞，是基因治疗研究的一个重要环节，可分为非病毒介导的基因转移和病毒介导的基因转移；外源基因表达的筛检，一般利用载体中的标记基因对转染细胞进行筛检，再检测转化细胞中的标记基因表达情况；回输体内，将治疗基因修饰的细胞以不同的方式回输体内以发挥治疗作用。11. 人类基因组计划的基本任务及意义HCG内容包括人类基因组作图及序列分析，基因的鉴定、基因组研究技术的建立与创新、模式生物基因组作图和测序、信息系统的建立、存储及相应软件的开发、相关产业的开发等。HCG基本任务可用四张图谱来