THP-1单核细胞培养-文档.doc

这个是急性单核白血病细胞，悬浮的（如果养的时间很长了有的会贴壁），培养基用普通的1640就可以了，这里是这个细胞株的详细资料供参考。THP-1： human acute monocytic leukemiaOrigin: established from the peripheral blood of a 1-year-old boy with acute monocytic leukemia (AML) at relapse in 1978; the cells can be used for induction of differentiation studies; the cells were described to produce lysozyme and to be phagocytic; carries t(9;11)(p21;q23) leading to MLL-AF9 fusion geneMorphology: round, single cells in suspension, partly in clustersMedium: 90% RPMI 1640 + 10% FBSSubculture: maintain at 0.1-1.0 x 106 cells/ml; split 1:2 to 1:3 every 3-4 days; seed out at ca. 0.5 x 106 cells/mlIncubation: at 37 C with 5% CO2Doubling time: ca. 35-50 hoursHarvest: saturation density at about 1.0 x 106 cells/mlStorage: frozen with 70% medium, 20% FBS, 10% DMSO at about 5 x 106 cells/mlMycoplasma: contamination was eliminated with Ciprobay (ciprofloxacin), then negative in DAPI, microbiological culture, PCR assaysImmunology: CD3 -, CD4 +, CD13 +, CD14 (+), CD15 +, CD19 -, CD33 (+), CD34 -, CD68 +, HLA-DR +Fingerprint: multiplex PCR of minisatellite markers revealed a unique DNA profileSpecies: confirmed as human with IEF of AST, MDH, NPCytogenetics: human near-tetraploid karyotype - 94(88-96)XY/XXY, -Y, +1, +3, +6, +6, -8, -13, -19, -22, -22, +2mar, add(1)(p11), del(1)(q42.2), i(2q), del(p21)x2-4, i(7p), der(9)t(9;11)(p22;q23)i(9)(p10)x2, der(11)t(9;11)(p22;q23)x2, add(12)(q24)x1-2, der(13)t(8;13)(p11;p12), add(?18)(q21) - carries t(9;11) associated with AML M5Viruses: ELISA: reverse transcriptase negative; PCR: EBV -, HBV -, HCV -, HHV-8 -, HIV -, HTLV-I/II - THP-1单核细胞是悬浮生长的细胞，用164010FBS是很容易养的，但复苏的细胞可适当加量至20%FBS。国产与进口的血清都行。培养用的血清必须用胎牛血清，小牛血清中含有微量的胆红素对THP-1单核细胞影响较大。培养基中最好能够加入足够的L-GLn和丙酮酸，以及非必需氨基酸，特别是前两者对于细胞的状态至关重要。尽量使用一次性培养瓶，如果没有条件，重复使用的培养瓶一定要洗干净，切记，切记，否则THP-1单核细胞吞噬杂质后很容易活化死亡。THP-1单核细胞喜欢酸性环境，记住这一点宁酸勿碱。倍增时间小于24小时。THP-1细胞可以传很多代，因此不要担心细胞活性问题，只要耐心及细心。我正在培养两种人B淋巴细胞，L721.221, Raji。对细胞状态好坏的鉴别有一点心得，希望和大家讨论。我们的配方是： (2x1000ml)RPMI Medium 1640, 10.4g, 2x1袋L-Glutamine, 2mmol/L, 2x300mg2-Mercapto-ethanol, 50umol/L, 2x3.9ulPyruvic acid, sodium salt, 1mmol/L, 2x110mgHepes Free acid, - 2x1.5gSodium bicarbonate, - 2x1.5gGentamyoin sulfate injection,50 U/ml, 2x50000 UDDW =2x1000mlpH =7.2立即，0.22um 滤菌=4度密封保存用前加10%NBS。一到两个月，需要往保存的1640中加原量的L-Glutamine（分解了）。长的好的细胞有下面几点特征：1. 培养液：澄清，能很快变黄（5CO2培养箱，12h之内），说明增殖快2. 低倍镜（10X10): 细胞透亮，“晶晶亮”，大小均一，其中还有个别“超级大个子”，是处于分裂前期的细胞，胞膜完整，不是细胞肿胀。3. 低倍镜（10X10): 聚集悬浮生长的细胞，通常能看到一簇一簇的细胞群，应该就是一个个“克隆”吧。4. 低倍镜（10X10): 细胞容易悬浮，容易随培养液“四处飘荡”，即使形成较大的细胞簇，也是“飘飘荡荡”的。5. 高倍镜（10X40): 大小钧一，形态规则，胞膜完整。长得不好的细胞正好与前面相反：1. 培养液: 有浑浊感，不变黄（几天甚至几星期都是红的），细胞根本不在呼吸代谢。2. 低倍镜（10X10): 细胞黯淡无光，几乎看不到“大个头”的细胞。3. 低倍镜（10X10): 很少有小簇细胞群，（若是细胞密度过大造成细胞状态不好，只有很