基因工程学原理内蒙古大学.ppt

第七章克隆基因的表达,邢万金内蒙古大学生命科学学院,二、克隆基因的表达,外源基因,mRNA,RNAPol,载体,外源基因,大肠杆菌,一、基因克隆,第一节外源基因在原核细胞中的表达,1.真核生物的基因用cDNA,2.不能直接用真核基因组DNA（带有内含子）,3.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）,5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害,4.有Shine-Dalgarno（S-D）序列,一、原核表达真核基因的注意事项,是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。,大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。,二、原核生物基因表达的调控元件,1.启动子,-35Box和-10Box,（1）启动子序列,大肠杆菌启动子的一致序列,ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTCCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAATTTATTCCATGTCACACTTTTCGCATCTTTGTTATGCTATGGTTATTTGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACGCCGTGATTATAGACACTTTTGTTACGCGTTTTTGTCATGGCTTTGGTCAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCCAAAACGTGTTTTTTGTTGTTAATTCGGTGTAGACTTGTAAACCTACATAATCGACTTGTAAACCAAATTGAAAAGATTTAGGTTTACAAGTCTACAACGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTCAAAAAAATACTTGTGCAAAAAATTGGGATCCCTATAATGCGCCTCCGTCAATTTTTCTATTGCGGCCTGCGGAGAACTCCCTATAATGCGCCTCCATAAAATAAATGCTTGACTCTGTAGCGGGAAGGCGTATTATGCACACCCCG,-35region-10region,laclacIgalP2araBADaraCtrpbioAbioBtRNAtyrrrnD1rrnE1rrnA1,一致序列,TCTTGACAT.11-15bp.TATAAT.5-8bp.A51423882847964534541799544595196C55T48G42,转录起始位点,5-TTGACA-3,5-TATAAT-3,2）-10box（PribnowBox）,TTGACA,TATAAT,转录起始位点,17bp,5,核糖体结合位点,RNA聚合酶s亚基的识别位点。,1）-35box（Sextamabox）,原核启动子共有序列的功能,2.翻译的起始位点,（1）核糖体结合位点（RBS）,1）Shine-Dalgarno（SD）序列：,mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。,S-D序列距离AUG的距离也影响翻译,核糖体小亚基,位于SD序列后，目的基因前。,2）转录终止子,3）起始密码,在表达载体克隆位点的下游所设计一段转录终止序列。,AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）,大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃。,4）终止密码,5）翻译增强子,Translationenhancer,能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。,T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段。,（1）强启动子,能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。,（2）低水平的基础转录,不诱导时很少表达。,（3）应是可诱导型的,用温度或化学试剂诱导。,1.最佳启动子必须具备的条件,三、基因工程常用的原核启动子,2.基因工程常用的原核生物启动子,（1）乳糖启动子lac,1）来源,可用乳糖或其类似物IPTG诱导。,来自于大肠杆菌的乳糖操纵子：,2）结构,CAP结合区RNA聚合酶结合区阻遏物结合区核糖体结合区（包含lacZ的前8个密码）,HaeIII片断（“可移动的lac启动子小片断”）。,203bp,（2）色氨酸启动子trp,trpR,阻遏蛋白基因；,P1,P2,启动子；,O,操纵基因；,衰减子,来自大肠杆菌色氨酸操纵子:,（3）PL和PR启动子,1）来源,N:抗终止蛋白；Cro:抗阻遏蛋白(裂解必需的）；,cI,cII,cIII:阻遏蛋白；P:启动子；O:操纵子。,R:右；L:左,噬菌体的启动子(比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高):,阻遏物,转录,转录,当cI合成后，与OL和OR结合阻止RNA聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进PM使cI进一步转录。进入溶原期。,早期左边转录,早期右边转录,3）调节基因用cI857,42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录,28oC时阻遏PL，外源基因不转录。,是一个温度敏感性的突变基因：,2）表达载体常用噬菌体启动子PL,（4）大肠杆菌表达常用的启动子,四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,1.细胞质中表达,（1）包涵体（inclusionbody）,细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。,50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。,1）组成成分,2）形成原因,重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等。,表达量过高。含硫氨基酸多。温度高或胞内pH接近蛋白的等电点。重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白。,3）包涵体表达的优点,重组蛋白易于分离、免受细菌蛋白酶降解、不损害寄主细胞,回收的蛋白生物活性差。,4）缺点,5）减少包涵体形成的策略,降低重组菌的生长温度。添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。供给丰富的培养基，最佳培养条件，如氧、pH等。,2.周质中表达,（1）周质（periplasm）,格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。,容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。,（2）周质表达的优点,一般位于N端，为15-30aa。真核与原核的结构相似,功能相似，可以互换。,（3）信号肽（signalpeptide）,phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）、肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等,大肠杆菌的信号肽：,1）常用的原核信号肽,胡萝卜欧氏杆菌PelB蛋白。,金黄色葡萄球菌的蛋白A。,枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶（endoglucanase）。,由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。,溶血素（hemolysin）、,使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。,3.胞外表达,细菌素释放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)。,（1）策略,与大肠杆菌细胞的分泌蛋白融合表达。,（2）优点,1）蛋白质受酶解作用最少,2）蛋白质容易纯化（胞外蛋白种类很少）,（3）缺点,1）外源真核蛋白一般不会被分泌到胞外,2）分泌的量很稀。,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,（1）优点,五、几种类型的原核表达载体,1.非融合型表达载体,产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。,（2）缺点,容易被宿主蛋白酶破坏、或形成包涵体。,哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。,（1）pKK223-3载体,1）组成结构：,强启动子:tac（trp-lac）:,trp的-35区,lacUV5的-10区,lacO操纵基因,操纵基因：,终止子：,调节基因：,宿主菌染色体上的乳糖操纵子调节基因LacI。,rrnB的强终止子,S-D,插入位点区,S-D序列和插入位点区：,载体的其余部分：,来自pBR322质粒。,2）表达诱导,宿主lacI,IPTG,阻遏物,IPTG,RNA聚合酶,EcoRISmaIBamHISalIPstIHindIII,EcoRISmaIBamHISalIPstIHindIII,与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,如：pINIII系列,2.分泌型表达载体,pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,（1）组成结构,Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。,调节基因：lacIS-D序列和ATG。,大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。,插入位点区（多克隆位点）。,强启动子：,分泌信号肽：,EcoRI,HindIII,BamHI,外源基因产物蛋白与载体上的菌体蛋白连接在一起。,1）启动子：tac2）操纵基因：lacP3）调节基因：lacI4）S-D序列5）ori：pBR322ori6）GST(谷胱甘肽S转移酶）,3.融合蛋白表达载体系统-pGEX系列,（1）优点,（2）组成结构,便于分离和纯化。便于溶解,（3）产物分离,用GlutathioneSepharose亲和层析柱分离纯化，凝血酶或Xa因子把外源蛋白从GST上切下来。,column,GST,凝血酶,可再利用,目的蛋白,洗脱,再利用,收集,（4）几种pGEX的多克隆位点,1）pGEX-1T,2）pGEX-2X,3）pGEX-3X,（5）其他融合蛋白系统,1）His-tag（组氨酸标签）：,在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。,His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,如pET-his等。,系列载体一般提供全部三种插入框：,ZUV5载体:,Z2载体:,Z3载体:,缺乏蛋白质的加工（如糖基化、氨基酸修饰等）。,六、原核细胞表达的缺陷,人胰岛素在大肠杆菌中的表达,溴化氰,Cyanogenbromide：,酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。,第二节外源基因在真核细胞中的表达,外源基因,（1）有E.coli的复制起点,1.酵母克隆载体的组件,一、在酵母中表达,Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;,（5）有合适的克隆位点。,（4）有酵母的选择标记,Ori,（3）有大