高效液相色谱法

第四章高效液相色谱法,一、色谱法概述,混合物最有效的分离、分析方法。俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素，色谱原型。色谱法是一种分离技术。混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。一相固定不动，称为固定相。另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。,（动画）,1、高效液相色谱法的特性,特点：高压、高效、高速、高灵敏高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。LCGC互补性,液相色谱仪,2、色谱基本参数与流出曲线的表征,1.基线无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.保留值,（1）时间表示的保留值保留时间(tR)：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；,（动画）,死时间(tM)：不与固定相作用的气体(如空气)的保留时间；调整保留时间（tR）：tR=tRtM,（2）用体积表示的保留值,保留体积（VR）：VR=tRqvqv为柱出口处的载气流量，单位：mL/min。死体积（VM）：VM=tMqv调整保留体积(VR)：VR=VRVM,3.相对保留值r21,组分2与组分1调整保留值之比：r21=tR2/tR1=VR2/VR1,相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。,4.区域宽度,衡量色谱峰宽度的参数，三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354。（3）峰底宽(Wb)：Wb=4。,2.相平衡参数（1）分配系数（partitioncoefficient）K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：,分配系数是色谱分离的依据。,分配系数K的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。,3.分配比（partitionradio）k,一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。,1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3.分配比可以由实验测得。,分配比也称：容量因子(capacityfactor)和容量比(capacityradio)；,4.容量因子与分配系数的关系,式中为相比。填充柱相比：635；毛细管柱的相比：501500。容量因子越大，保留时间越长。VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同；气-液色谱柱：VS为固定液体积；气-固色谱柱：VS为吸附剂表面容量。,5.分配比与保留时间的关系,滞留因子（retardationfactor）：,us：组分在分离柱内的线速率；u：流动相在分离柱内的线速度；滞留因子RS也可以用质量分数w表示：,若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为tR和tM，则,tR=tM(1+k),通过上式可直接由实验获得的保留值求出分配比。,6.分离因子,分离因子（也称为选择性因子）也可用来衡量两物质的分离程度，用表示。,7.色谱流出曲线的数学描述,色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线上的浓度与时间的关系为,当色谱峰为非正态分布时，可按正态分布函数加指数衰减函数构建关系式。,色谱理论需要解决的问题？,色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论。,塔板理论的假设：(1)每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2)将载气看作成脉动（间歇）过程；(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4)每次分配的分配系数相同。,3.2.2塔板理论-柱分离效能指标,1.塔板理论（platetheory）半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复。,（动画）,色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为,保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!,理论塔板数与色谱参数之间的关系为,n=L/H色谱峰的方差与柱长或保留时间的关系为：,2.有效塔板数和有效塔板高度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：,3.塔板理论的特点和不足,(1)当L一定时，n越大(H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,(2)不同物质在同一色谱柱上的K不同，用n有效和H有效作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,(3)柱效的高低不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,3.2.3速率理论-影响柱效的因素,1.速率方程（也称范弟姆特方程式）H=A+B/u+CuH：理论塔板高度，u：载气的线速率(cm/s)。,减小A、B、C三项可提高柱效。存在着最佳流速。A，B，C三项各与哪些因素有关？,A涡流扩散项,A=2dpdp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,B/u分子扩散项,B=2Dg：弯曲因子，填充柱色谱，Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价阳离子的KB/A值顺序：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+对于季胺型阴离子交换树脂，一价阴离子的KB/A值顺序：ClO4-I-HSO4-SCN-NO3-Br-NO2-CN-Cl-BrO3-OH-HCO3-H2PO4-IO3-CH3COO-F-,4.4.5离子对色谱ionpairchromatography,将一种(或多种)与溶质离子电荷相反的离子(对离子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏水性离子对，能够在两相之间进行分配。阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十六烷基三甲胺。阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。,基本原理：,形成的离子对化合物X+Y-，在两相间进行分配：X+水相+Y-水相=X+Y-有机相平衡常数：,溶质在两相间的分配系数DX为：,不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同，分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同，从而实现色谱分离。,离子对的容量因子k可表示为：,则组分的保留时间：,保留值随KXY和Y-水相的增大而延长，而KXY取决于对离子和有机相的性质，则控制流动相中加入的对离子特性和浓度可以调整组分保留时间，达到提高色谱分离选择性的目的。,4.4.6排阻色谱size-exclusionchromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)。,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰。相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离。,基本原理：,色谱柱的总体积为Vtol=Vm+Vp+VgVm为死体积，即对应于完全排斥分子流出体积；Vp为孔体积；Vg为凝胶体积（去除孔体积）。组分的保留体积为VR=Vm+KVp,基本原理：,分配系数：,分子完全排斥时，K=0；可自由进入孔道时，K=1；部分进入时，K=0；保留体积位于：VmVm+Vp,4.4.7亲和色谱(AC)Affinitychromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,间隔基：环氧、联胺等；配基：酶、抗原等；这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,1.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。种类有限，应用面相对较窄。结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：510m。,4.3.1液相色谱固定相,2.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。,（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为12m的多孔硅胶。表面积小，柱容量低。,（3）化学键合固定相,化学键合固定相：应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：SiOCb.硅氧硅碳键型：SiOSiC稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，应用最广。c.硅碳键型：SiCd.硅氮键型：SiN,化学键合固定相的特点：,（1）传质快，表面无深凹陷。（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水，耐光，耐有机溶剂，稳定。（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。（5）有利于梯度洗脱。,存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主。,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂。（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）。树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）。（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。,4.空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等，多孔网状结构。水为流动相，适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,4.3.2液相色谱的流动相,1.流动相特性（1）流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况。,（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，正相，极性柱也称正相柱。,（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,3.流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时，首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4.选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失，酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,液相色谱仪,液相色谱仪,液相色谱仪,1.结构流程,4.2.2主要部件,(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150105350105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(10m)，液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳，脉冲小，流量稳定可调，耐腐蚀等特性。,（动画）,(2)梯度淋洗装置,外梯度（高压梯度）:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,内梯度（低压梯度）:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,(3)进样装置,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，结构如图所示：,(4)高效分离柱,柱体为直形不锈钢管，内径16mm，柱长540cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(5)检测器,紫外检测器示差折光检测器荧光检测器光电二极管阵列检测器,4.2.3检测器,a.紫外检测器应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：,灵敏度高；线性范围宽；流通池可做得很小(1mm10mm，容积8L)；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,b.光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定