痰标本的前处理.docVIP

_痰标本的前处理方法消化 除菌（美国CDC建议方法）1. N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠法（NALC-NaOH）(使用3D培养仪，推荐) N-乙酰-L-半胱胺酸是一种黏液溶解剂，可用来快速地将痰标本消化，并除去杂菌， NaOH在 痰标本中的最终浓度为1% 。在标本处理液中乙酰半胱胺酸会很快地失去活性，因此消化液应每日新鲜配制。消化液中会含有吸附了重金属离子的柠檬酸钠，它可以使乙酰半胱胺酸失去活性。* 所需材料 N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠溶液（NALC-NaOH） 离心管，50ml 培养基：琼脂培养基，参阅书中7H-10或7H-11；蛋黄培养基，查阅 Lowentein-Jensen(LJ) 或美国Trudeau学会 0.067M磷酸缓冲液，pH6.8 或无菌蒸馏水。 0.2%牛白蛋白盐水溶液l 试剂准备 1）将NaOH和柠檬酸钠混合均匀（见表一）放带有螺旋盖子的烧瓶中储存备用，当加入乙酰半胱胺酸后，此标本处理液应于24小时内使用，因为乙酰半胱胺酸久置后会失去液化活性 。 表一 NALC-NaOH消化处理液的配制 消化液体积 4%NaOH * 柠檬酸钠 2H2O * NALC (ml) (ml) (ml) (克) 50 25 25 0.25100 50 50 0.5200 100 100 1500 250 250 2.501000 500 500 5.00 * 4.0克NaOH加到100ml蒸馏水中 * 2.9克柠檬酸钠 2H2O(或2.6克无水柠檬酸钠)加到100ml蒸馏水中2) 0.067M磷酸缓冲液，pH6.8 储存液：(a ) 磷酸氢二钠：将9.47克无水Na2HPO4溶解于1升蒸馏水中。 (b) 将9.07克KH2PO4溶解于1升蒸馏水中。 pH6.8缓冲液：将50ml (a) 液与50ml (b)液混合，调整pH至6.8。加入(a)液 或b液可分别增加 或降低溶液的pH值。3) 0.2%牛白蛋白液(使用3D培养瓶培养无须此试剂)2%储存液：将0.85克NaCL溶解在100ml蒸馏水中，加入2克牛白蛋白片断V，用旋涡振荡混匀，或用磁性搅拌器轻轻搅拌混匀。用4%NaOH调整pH为6.8，用过滤膜或Seitz过滤 除菌。0.2%应用液：将上述储存液用0.85%无菌盐水作1：10的稀释。 痰标本的处理过程1 将不超过10ml的痰标本加入到50ml的塑料离心管内，加入等体积的NALC-NaOH溶液。 可使用同一台离心机处理多个标本（例如，同时处理8个标本）。2 加入消化液后，旋紧离心管的盖子，用搅拌器充分混匀至标本液化为止（约5-20秒/管）， 颠倒混匀离心管，以确保NALC-NaOH溶液与管内标本充分接触。注意：避免极剧烈的震动，以减少乙酰半胱胺酸的氧化及失活。3 将离心管放室温15分钟除菌。为达到更佳的除菌效果，可将NaOH的浓度增加至5%-6%， 而不是增加标本消化处理时间。4 用无菌蒸馏水或无菌磷酸缓冲液 (pH6.8) 将已消化除菌的标本稀释至离心管上50ml的标志 处，在标本离心之前减少NaOH的继续作用，防止分支杆菌被破坏。5 盖紧盖子，旋涡震荡或颠倒混匀。6 3000 g离心15分钟（适当RCF结合时间可获得95%的沉淀）,最好使用能密封的离心杯，以防 止气溶胶播散。如无这种可密封的离心杯，可适当调整离心过程，可参照Hall的方法。7 离心后，将上清液倒入盛有消毒剂的容器内，用侵过消毒剂的纱布擦净试管的边缘，再盖上 试管盖子。8，在沉淀物中加入1-2ml的磷酸缓冲液（用于3D培养）或0.2%的牛白蛋白溶液（用于涂片）混匀备用。Petroffs氢氧化钠法（NaOH） NaOH不仅对非抗酸菌有毒性，而且对分枝杆菌也具有毒性；因此整个消化过程应严格按照要求进行。消化液NaOH的浓度应为2%-4%，这样才能更有效的将痰标本消化及除菌。所需材料 NaOH溶液（2%-4%） 2N盐酸（HCl）溶液或盐酸-酚红指示剂（HCl-phenol red） 试剂准备 NaOH 将2克NaOH（或4克）溶解在100ml蒸馏水中，使之成为2%（或4%）的浓度，高压灭菌。 2N HCl 将33ml浓HCl缓缓加入到200ml水中（注意应将酸加到水中，无将水往酸中加），高压灭菌。 酚红指示剂 将20ml 酚红溶液（4%NaOH中加0.4）和85ml浓HCl加入到蒸馏水中，使最终体积为1000ml. 注意：酚红溶液也可单独使用。痰标本处理过程1） 将10ml标本加到50ml刻度的带螺旋盖子的试管中。加入等体积的上述NaOH溶液。2） 用振荡仪充分振摇15分钟，如果同时能进行搅拌以利于消化，则效果更好，然后放置15分钟。3） 3000 g离心15分钟。4） 离心沉淀后，将上清液弃去，再加盐酸。可以先加1滴指示剂溶液，再一滴一滴的加盐酸；也可以直接加盐酸酚红指示剂，当指示剂的颜色由红变为稳定的黄色时，即可停止加盐酸。5） 将沉淀混匀后即可接种在适当的培养基上。6） 涂片、自然干燥、加热固定、染色，然后进行镜检。注意：1， 对于任何消化除菌过程，允许的污染率为5%-3%。如果污染率明显地高于5%，则应检查消化过程，消化不足培养物会被高度污染。消化过度会使得污染率低于3%，并有可能影响培养的阳性率。当这两种情况出现时，最好是对NaOH的浓度进行调整，而不是延长或减少标本消化的时间。当某个