ISHprotocol荧光原位杂交技术实验方案.doc

地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程：1、 多甲固定：应尽量在半个小时内完成。（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。）2、 切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。（选用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。（重新固定10-15min）3、 用0.1MPB洗切片3*5min4、 切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。杂交液：（20ml） 藏于-20度20*SSC 4ml硫酸葡聚糖 4g去离子甲酰胺 10ml将他们溶解后，加入以下物质：Poly A（10mg/ml） 0.5 mlSsDNA（10mg/ml） 0.5 mltRNA （10mg/ml） 0.5 mlDTT (1M) 2ml50*Denhardts 0.2ml上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交会有一个很高的背景）在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但是前提是不能让切片干燥。杂交后处理;制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是55度。注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT（将1.2g的DTT加入到800ml的SSC中）杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇水浴 中按照下面的要求来洗片：快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55度1*10min 0.5*SSC（10mMDTT）室温将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。检测：将切片转移到TBS缓冲液中（100mM tris-HCl，150mM NaCl，PH=7.5），将切片在TBS缓冲液中洗3*5min，封闭：（可选）将切片放在封闭液中放置30min（封闭液配方:TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）,将切片拿出封闭液中，用地高辛抗体和切片在TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）于室温下孵育至少4小时，然后在TBS中洗3*5min ，然后在去离子水洗涤几次以去除盐，最后用抗淬灭剂分片观察原位杂交要做的对照;1、 切片中mRNA的质量（前提是新鲜的组织样品）和protocol的有效性。 PolyT探针：如果PolyT探针杂交的信号很弱的话，说明切片的RNA已经降解比较严重。2、 杂交特异性对照：检测探针只是和RNA结合，用RNA酶处理后如果没有杂交信号的，则说明杂交只是和RNA结合。（注意，RNA酶的处理应该在固定以后用PBS洗两次*5min立即进行） 用正义和反义探针来杂交，如果用正义探针杂交得不到任何的信号，则可以说明杂交的信号是特异性的杂交预处理：1、 在37 恒温箱内干燥切片后，滴加 5-10g/ml蛋白酶K，置37 湿盒内孵育30min， 475 酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。一般应用蛋白酶K 1g/ml(于0.1 mol/L Tris,50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中)，37孵育1520 min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用，应用胃蛋白酶(Pepsin)20100 g/ml(用0.1 N HCl配)37、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。2、0.25% 醋酸酐10min, 经70 2SSC漂洗、40 2SSC各漂洗15min，2SSC 3min，切片经75-100% 酒精梯度脱水。1. 蛋白酶K能消化和暴露被遮蔽的靶核酸，以增加探针的可结合性。蛋白酶K 浓度过低，不能使靶核酸有效暴露，浓度过高则组织消化过度，也会影响检测结果。蛋白酶K须用蛋白酶K缓冲液配制(0.1mol/L Tris-HCl PH 8.0，50mmol/L EDTA，经高压灭菌后备用)，蛋白酶K应新鲜配制，低温冰箱内分装保存。蛋白酶K消化组织切片是原位杂交实验流程中重要环节，蛋白酶K浓度应力求准确无误。2. 根据组织类型、固定液的种类，固定时间和切片的厚薄的不同，蛋白酶K浓度也存在差异，选用蛋白酶K最佳消化浓度是原位杂交成功的必要条件，不可省略预杂交预杂交液;临用前加；预杂交液不加配制：先以去离子甲酰胺与SSC于室温混合，加入硫酸葡聚糖于50促溶，依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室温常需数小时才能完全溶解。有时需旋涡振荡。定容后充分混合。根据使用方便可分装（最好用铝箔将瓶子包好）存于4，可达数月。注意，杂交缓冲液在使用前切忌污染1、 将DEPC处理的切片经ddH2O漂洗 25min2、 按组织片大小， 每张切片滴加40l杂交液，置37 温盒内2小时杂交1、 抖去甩干杂交溶液，用DAKO魔笔沿组织周围划圈，滴加30l 探针杂交液/每张切片(内含20ng地高辛标记的探针)，在某温度下（改温度为：TM- ）湿盒内孵育过夜杂交液内加入变性剪切的鲑鱼精子DNA在杂交前加入，与其它杂交液分开储存。杂交液能在20保存几个月杂交后处理1、将切片置37 2SSC中漂洗210min。 2. 在37 2SSC 漂洗215min、1SSC 漂洗215min、0.25SSC 漂洗215min，均需用振荡漂洗切片。最适复性温度（Optimunm renaturationtemperature, TOR）：Tor =Tm 25苛刻复性温度：Ts = Tm (10 或15)非苛刻复性温度：Tns =Tm (30 或35)在2SSC 反应液中，可以根据下列公式计算最适复性温度：TOr =0.51 (G+C%)+47减低背景染色背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后(Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强了背景染色。4杂交后漂洗(1)2SSC液内振动移除盖片。(2)2SSC 55 10 min2。(3)05SSC 50 5 min2。(4)缓冲液(含05%封阻试剂，用缓冲液溶解)37 30 min。(5)缓冲液(100 mmol/L TrisHCl,150 mmol/L NaCl pH75)15 min,室温。(6)酶标地高辛抗体(15 000，应用缓冲液解释)37 30 min。(7)缓冲液 15 min2，室温。(8)缓冲液(100 mmol/L TrisHCl,100 mmol/L NaCl,50 mmol/L MgCl2,pH95)室温，2 min。(2)杂交后漂洗其目的是去除未参与杂交体形成的过剩探针,消除与组织或细胞之间的非特异性结合的探针,降低背景染色,增加信/噪比。将杂交玻片从湿盒(或杂交仪)中取出,用2SSC将盖玻片洗脱,2SSC 30洗2次,每次15 min;1SSC 42洗2次,每次15 min;05SSC 37洗2次,每次15 min,TBS缓冲液洗2次。注意在漂洗过程中切不要使切片干燥。(5)对照试验阳性对照:用已知含靶核酸序列的组织作对照。阴性对照:用已知不含待测靶核酸序列的组织作对照。用免疫组化检测方法来确定杂交信号的分布。省略标记探针。DNA酶消化靶DNA对照。HJ1(6)非特异性染色非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。如过氧化物酶用3% H2O2处理510 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。NBT/BCIP显示碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。必须根据检测系统不同的标记酶作不同的内源酶处理。2. 探针的长度原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，探针浓度必须给予该实验最大信噪比，因为背景着色度高低与探针浓度有关。最佳探针浓度是最低探针浓度达到靶核酸的最大饱和结合度为目的。探针浓度按其种类而略有不同，放射性标记cRNA探针的浓度为0.5ng/l，而非放射性标记cRNA探针的浓度1.0ng/l 。杂交液的量要适当，每张切片以30-50l为宜。保持杂交液不流失的关键是，载玻片的清洁处理必须彻底，应用杂交罩等也很必要。3.杂交的温度和时间设置和调整杂交温度是RNA原位杂交的重要环节。杂交温度应低于解链或融解温度(melting temperature Tm)20-30。多数RNA原位杂交Tm为95，由于这一温度对保存组织形态完整和组织切片的粘附将产生不利影响，为此在杂交液中常以增加甲酰胺浓度来降低Tm值，因为每增加1 甲酰胺浓度可降低0.72。另外杂交体中GC的百分比，杂交体长度以及杂交液中Na+的浓度也与Tm呈正相关。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短，杂交时间过短会造成杂交不完全，杂交时间过长会增加非特异性着色。一般RNA原位杂交采用杂交孵育过夜，在黑暗环境下进行，可以避免光线对甲酰胺的电离作用。为利于mRNA检测，固定时间不要超过36小时，以免引起RNA与蛋白质之间发生交联。(三)预杂交(1)切片用DEPC处理的PBS PH7.4(140mmol/L NaCl ，2.7mmol KCl,10mmol/L Na2HPO4, 1.8mmol/L KH2PO4) 孵育25min，再用DEPC处理的含100mmol/L 苷氨酸(Glycine)PBS 孵育切片25min。(2)用DEPC处理的含0.3% Triton X-100 PBS孵育15min。(3)用DEPC处理的PBS漂洗25min。(4)冰冻切片用TE缓冲液（100mmol/L Tris-HCl ,50 mmol/L EDTA PH 8.0）不含RNA酶的1g/ml蛋白酶K，在37 下通透切片30 min。石蜡切片用TE缓冲液配制的不含RNA酶的5-20g/ml蛋白酶K，在37 下通透切片30min。(5)在4 下用DEPC处理的4 多聚甲醛PBS 溶液作后固定5min。(6)再用DEPC 处理的PBS冲洗切片25min。(7)切片作酸酐处理，处理液含0.25醋酸酐、0.1mol/L 三乙醇胺(Triethanolamine TEA)PH8.0，振荡漂洗25min。(8)在37 孵育切片后，杂交缓冲液冲洗（含50 去离子甲酰胺的4SSC），至少10 min。注意事项(1)切片的通透化是RNA原位杂交关键步骤，特别对回顾性资料尤为重要，因固定液种类和固定时间的不同，需作最佳通透化条件探索，包括蛋白酶K浓度，孵育时间20-30min之间调整，甚至采用0.2mol/L HCL配制的0.1 胃蛋白酶。(2)由于醋酸酐极不稳定，宜将醋酸酐在使用前加到TEA缓冲液中。(3)1SSC = 150mmol/L NaCl,15mmol/L sodium citrate pH7.2。(四)免疫荧光检测1. 滴加封闭缓冲液(100mmol/L Tris-HCl PH7.5、150mmol/L NaCl、2% BSA) 置37 湿盒内30min，以封闭非特异性结合部位。2. 沥干细胞片，滴加抗地高辛抗体(1:200、1:500用封闭缓冲液配制) 在37 内45 min。3. 用Buffer A PH7.5(100mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、0.05% Tween 20) 冲洗漂洗各5min。4. 由低浓度至高浓度(70%，90%，100%)各级酒精梯度脱水各5min。5. 空气中干燥细胞片。6. 滴加甘油显色混合液。注意事项甘油显色混合液的配制：9份甘油比1份(1mol/L Tris-HCl(PH7.5)， 2% 1.4-diaza-bicyclo-2.2.2-octane (DABCO)和DNA复染剂(或碘化丙啶Propidium iodide PI 500ng/ml)或 DAPI (75ng/ml)7. 在荧光显微镜下观察。3 预杂交和杂交(1)加约30 l预杂交液在每张载片上,室温孵育1 h。如加鲱鱼精子DNA,用前须在沸水浴中加热变性10 min,酵母tRNA不用加热。(2)预杂交后以2SSC漂洗,以吸水纸试干切片周围水份,应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo探针,浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素(proopiomelanocortin,POMC)mRNA的Oligo探针,其理想工作浓度为342 ng/ml(0 342 ng/l)。(3)加30 l杂交液在切片上,加硅化盖玻片,在37过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42。(4)次日室温2SSC液漂洗切片1 h。(5)1SSC漂洗切片1 h(室温)。(6)05SSC 37漂洗半小时。(7)05SSC室温漂洗半小时。(8)显示等方法同前述。Application Dilution Conc. g/ _lSufficient for.in situ hybridization1:5001:1000 0:20:42Denhardts液通常配成10，50或100的储备液配制：称取上述试剂，溶于800ml左右灭菌ddH2O中，定容至1000ml后，过滤后于-20保存备用。该液用于配制杂交液及予杂交液等。1蛋白酶（Proteinawe K, Pro.K） 蛋白酶K主要用于杂交前标本处理，其作用是使组织达到一定消化，利于检测分子的穿透，从而提高检测方法的敏感性，但各种组织在不同条件下消化程度不一，因此，具体应用时，应根据组织种类、温度确定反应时间及酶的浓度。过度消化可使组织形态结构遭到明显破坏，核酸分子也会受到影响。通常是将其配成储备液（1mg/ml），临用前，再配成工作液（约0.025mg/ml）。配制方法：精心称药，将二者充分混合后，分装成小份，-20存放，用时再取出冻融，余者弃去。（2）工作液（临用前配）：取储备液（1mg/ml）按1：40稀释，充分混合，即得约含Pro.K为25mg/ml的工作液。（3）关于P-K缓冲液的配制：称取上述试剂，充分混合即可。1mol/L 的Tris-HCl(pH8.0)：先将Tris于800ml ddH2O中溶解，用HCl将pH调至8.0,ddH2O定溶于1000ml，高压灭菌，室温备用即可。0.5mol/L的EDTA：称取EDTA溶于约600ml ddH2O中，常需60持续搅拌以助溶，滴加NaOH至pH接近8.0时，EDTA才开始溶解。待完全溶解后，冷却至室温，NaOH调pH至8.0,ddH2O定溶至1000ml，高压灭菌，室温备用。2甘氨酸（1）