第五讲_组培应用

植物组织培养应用,组培快繁,脱毒,超低温保存,人工种子,组培快繁,组培快繁,组织培养快速繁殖（rapidpropogation），又称离体快繁（invitrorapidpropagation），是指将植物材料放在试管内，给予人工培养基合适的条件，以达到高速增殖的目的，所以也称为快速无性繁殖（rapidclonalpropagation）。,为什么要快繁？,有些植物由于收种困难或种子的发芽率很低；栽种时耗种量大，繁殖系数低，如，贝母、番红花；组培方法获得无毒苗；节省土地，10万株苗/30平米；,1快繁体系的建立,1）无菌株系材料的选择选择适当的外植体对于快速繁殖能否成功非常重要，对于快速繁殖的药用植物品种，一般应选择生产上大量推广使用的具有优良性状或能预见未来有商业开发前景的品种。,选用接种外植体时，应采摘具有本品种特征，且生长健壮的植株幼嫩部位，比较好的是茎尖。茎尖形态已基本形成，生长速度快，遗传性状稳定，但是茎尖往往受到材料来源的限制；带顶芽或腋芽的幼嫩茎段或枝条也可以作为外植体。,取材时应该考虑的问题,a，外植体大小外植体的大小通常由培养的目的决定。快繁：带腋芽的茎段或枝条，0.5cm左右，过小易死亡，过大不容易诱导分化出芽而且易污染；脱毒：需要使用顶端分生组织，外植体越小感染病毒机会越小，但培养难度加大，反之亦然。,b，植株的生理状态一般取芽已膨大但芽鳞还未张开时最为合适，此时芽生长旺盛，并有芽鳞片的保护，不易污染；对于某些需要低温、高温或特殊处理才能打破休眠的块茎、鳞茎、球茎，常常需要处理后才能剥取茎尖进行培养。,c，芽在植株上的部位芽：顶芽、侧芽、腋芽在一些草本植物（如菊花，香石竹）中，使用顶芽或上部的芽做分生组织成功率常常比侧芽或基部的芽要高。木本植物中常用腋芽做材料，性状稳定，再生所需时间短，再生植株健壮，适应强,d，取材植株的年龄供体植株的年龄对不定芽和愈伤组织的形成影响明显；幼龄株：繁殖系数高；老龄株：繁殖系数下降多年生木本植物随树龄增加，分生组织、茎尖和芽的培养困难很多。,材料除菌接种,材料表面清洗杀菌剂消毒：升汞/次氯酸钠消毒后在无菌条件下切成合适大小的小段，接种到培养基上。,芽的增殖,芽增殖的4种方式1通过顶芽或腋芽直接产生丛生芽；2诱导不定芽增殖分化；3诱导不定体胚的产生4先诱导愈伤组织，然后增殖愈伤分化成株,壮苗与生根,壮苗培养：不加或少加激素，促使幼苗健壮；生根培养：基本培养基加低浓度或不加细胞分裂素，高浓度生长素。细胞分裂素/生长素高有利于芽生长；细胞分裂素/生长素低有利于根生长；,驯化、移栽,a，保持水分；b，选择合适的种植介质：疏松通气、保水，容易灭菌，如蛭石、沙子、谷壳、锯末等。c，防止菌类滋生：使用杀菌剂d，光照温度：试管苗从异养到自养，光照不能太弱适宜温度1825度。,脱毒,植物的脱毒培养,在植物生产中，病毒病是危害植物产量和质量的重要因素。,以无性繁殖方式为主的植物品种，在自然环境中长期经受各种病毒病的重复传播，导致结果：光合作用减弱；生长势变弱；品种退化；产量降低，减产30%以上。常见病毒病，黑斑病、花叶病、皱缩病,病毒的诊断,局部症状：病毒沿侵染点周围产生斑点，分褪绿斑、坏死斑、环状斑；系统症状：病毒侵染寄主后能够在整个植株中运输并产生危害，在叶片、茎、果等组织中产生危害。,植物受病毒危害后的外部症状,植株变小：矮缩、矮化、丛簇和扭曲，有时病毒侵染后不表现明显性状，称为潜伏侵染。植株矮化常减小叶片大小、叶间距以及叶片数减小，也可能引起果实种子变小。,叶片症状：花叶症状，病毒侵染后叶片不均匀褪绿；黄化症状，侵染病毒后叶片变黄；环斑及蚀纹，叶片出现单环纹或双环纹环斑，叶片上出现不规则纹线症状称为蚀纹。,发育异常畸形，叶片扭曲、皱缩、卷叶坏死，整个组织、器官或植株死亡,如何应对病毒病,对于病毒病，目前并无有效防治措施；利用茎尖分生组织脱毒培养，可以获得脱毒苗，恢复植物固有的优良性状。脱毒苗再通过克隆繁殖可以获得大量脱毒的优良种，供生产上使用。,脱毒技术1,热处理脱毒利用病毒和寄主植物对高温的忍耐程度差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，得到一小部分不含病毒的分生组织，进行无毒个体培养。热处理脱毒的原理：将植物置于高于正常温度环境中，组织内部病毒部分或全部钝化，但寄主植物细胞很少或不受到伤害。,高温钝化病毒主要表现在：高温可断裂病毒RNA；病毒内部酶裂解，造成病毒颗粒破坏；辅助酶钝化，如RNA聚合酶钝化导致RNA合成受阻；高温下蛋白质结构发生变化，病毒不能正确组装；,热处理脱毒处理温度的时间因物种和器官的生理状态而异，一般3540小时，短则几十分钟，长可达数月。,热处理方法,热水处理：热水处理对休眠芽效果比较好热空气处理：对活跃生长的茎尖效果好，既能消除病毒，也能使寄主植物有较高的存活机率。把旺盛生长的植物转移到3540度的热疗室处理一定时间，热处理后要立刻把茎尖切下来嫁接到无病的砧木上。,热处理脱毒的局限性,并非所有的病毒都对热处理敏感；延长寄主植物的热处理时间，也会钝化植物组织中的抗性因子；热处理以后仅有一小部分植株能够存活。,脱毒技术2,2茎尖脱毒培养植物茎尖不存在病毒，或病毒数量、种类少；病毒的复制速度不及茎尖细胞的生长速度，病毒难以进入到分生组织中。茎尖培养是生产无毒植株最重要、最有效的组培方法，在草本植物上广泛应用，在十几种木本植物上也取得了成功。,脱毒培养的方法,1从带病植株上切取茎尖、芽尖作为外植体，常规消毒后在培养基上培养成小植株，经过脱毒检测以后，将脱毒苗移栽到隔离区种植，作为原种繁殖。,2愈伤组织脱毒培养茎尖分生组织培养一个茎尖只能得到一株无毒苗，对繁殖率低的植物而言效率不高，如果先用组织培养产生愈伤组织，再从愈伤组织分化出无病毒植株，效率提高。,愈伤组织脱毒的原因,a，感染病毒的愈伤组织内还存在部分无病毒细胞；b，感染病毒的愈伤组织在分裂过程中产生新的无病毒细胞；c，愈伤组织中细胞之间的胞间联系减少，缺乏输导组织，病毒传导受限；d，通过连续的继代，选择了无病毒的或含有少量病毒的细胞簇。,3原生质体脱病毒培养类似于愈伤组织脱毒，Shepard报道得到4140株烟草再生植株，7.5%为无毒植株。4繁殖组织脱毒培养利用花组织培养获得无毒株。如珠心、胚珠，病毒不能进入珠心和胚珠。,5茎尖显微嫁接脱毒木本植物茎尖分生组织脱毒培养屡遭失败，后来提出一种显微嫁接技术。具体做法：将砧木种子经消毒后播于MS培养基，生长2周以后，把茎尖分生组织热脱毒后再嫁接到砧木上。,茎尖脱毒的理论基础,茎尖培养之所以能获得无毒苗，是由于病毒在植物体内分布不均匀，在顶端分生组织中是无毒的；病毒靠维管系统传播移动，分生组织中还没有形成维管束，病毒只能通过胞间连丝移动；分生组织代谢旺盛，钝化病毒的活性较高；顶端分生组织高浓度的激素浓度可能会抑制病毒增殖。,茎尖脱毒技术要领,1茎尖的剥取消毒后的材料放在解剖镜下，用解剖针或解剖刀把分生组织剥取下来，迅速放入茎尖培养基中。如果在空气中暴露时间过长，会失水死亡。剥取茎尖的原则是既要脱掉病毒，又要使茎尖容易成活，一般以0.1mm1mm之间为宜。离体茎尖越大越容易成活，但病毒越难根除。,2选用合适的培养基和激素茎尖剥离后一般采用低激素浓度的固体培养基；两阶段培养：第一阶段，以保证茎尖成活为主要目的；第二阶段，茎尖成活以后，长至23cm时更换培养基，以提高繁殖系数为主要目的。,3脱毒苗的移栽适合脱毒苗移栽的基质有珍珠岩、蛭石、泥沙等的混合物；幼苗健壮、有良好根系的苗容易成活；,4脱毒苗的田间管理脱毒苗移到大田以后，要特别严防病毒的再次感染。选好种植区，选在地势好，排水良好的地块；脱毒苗种植需建隔离网室，防止蚜虫进入；土传病毒还要对土壤进行消毒，周围环境也要整洁；不在同一块土地连作重茬。,病毒的复查,经脱毒处理的植物还会有少量带毒植株，所以要进行复查。复查的方法,a，指示植物法产生病状特征的寄主植物称为指示植物；具体操作：将待检测植物叶片加水和等量0.1M磷酸缓冲液（pH7.0）研磨成浆，然后混金刚砂末在指示植物叶面上轻轻摩擦，5min后清水清洗液面，放置自然生长观察是否发病。,b，抗血清鉴定法植物病毒由核酸和蛋白质组成，表面蛋白是一种抗原，注射到动物体内即可产生抗体。抗体存在于血清中称为抗血清，血清中的抗体能与抗原特异结合。不同病毒抗原产生的抗体都是特异的，用已知的抗血清可以鉴定未知病毒。,c，ELISA（酶联免疫法）,d，核酸分子杂交,核酸分子杂交的基本原理：同源的2条核酸序列在一定条件下可以按照碱基互补原则退火形成双链；根据使用的方法，被检测的核酸可以是提纯的，也可以是在细胞内杂交（原位杂交）；杂交探针：放射性标记或生物素、地高辛标记。,e，PCR检测,灵敏度高，特异性强缺点是易污染,超低温保存,植物资源的超低温保存,生物体的遗传物质从上一代传给子代，携带遗传物质的材料称为种质。这种携带遗传物质的材料，包括植物种子、根茎、块茎、树木苗木等统称为种质资源，也称为遗传资源或基因资源。,狭义的生物种质资源包括全部动植物家养品种、地方品种、新育成种以及育成的品系和遗传材料。广义的种质资源是指地球上所有生物种质的遗传资源。,植物组培种质资源保存概述,利用组织培养技术保存种质资源用相对较小的空间保存大量的种质；免遭病虫害侵袭；对于特殊材料，如远缘杂交后代、体细胞杂交种更适合用组织培养的方式保存；保存的种质便于交换和分发，减少检疫手续。,植物资源的超低温保存,种质资源超低温保存是指在-80度以下的超低温中保存种质资源的技术；超低温获得途径：干冰-79度超低温冰箱-80度液氮-196度,超低温下保存的材料代谢可以大大减慢、甚至终止代谢和衰老过程，保持生物材料的稳定性；超低温保存种质时常用液氮做冷源，冻存的设备是液氮罐，除了每隔4060天补充1次液氮不需要空调设备和其它昂贵设备，所需费用低廉，节约人力物力，所以在超低温保存中，液氮冷冻使用最多。,影响超低温保存的因素,1植物材料的特性冷冻前植物材料基因型的差异以及植物组织、细胞的生理状态是决定冷冻细胞活力的重要因素。一般来说，高细胞质、无液泡、薄壁的分生细胞存活率高于含大量液泡的大细胞；悬浮培养细胞处于指数生长期的细胞能得到最高的存活率，这时多数细胞处在比较理想的状态。,2冰冻前的预处理对材料进行抗旱锻炼或预培养能增强细胞的存活率。预处理措施：继代及同步培养；在高渗或冰冻保护剂培养基上预培养；零上低温驯化,3冰冻保护剂冰冻保护剂的使用能减少超低温保存造成的伤害。保护剂的作用：降低冰点；增强溶液黏性，防止冰晶生长；促进细胞在结冰早期进行保护性脱水。常用的冰冻保护剂DMSO、甘油,4冷冻速度慢冻法：样品以0.110度/min的速度缓慢降至-30-40度，平衡一段时间后转入液氮保存；适用于悬浮细胞和原生质体。快冻法：直接投入液氮中冷冻，温度下降速度3001000度/min；适合含水量比较少的材料，如花粉、种子、枝条。,逐级冷冻法：起先以较慢降低速度降温使细胞失水达到保护性的脱水，形成高浓度的溶质，然后分级降至-30度、-70度、-100度、-196度。干冻法：通过控制脱水速度和脱水程度，对植物材料进行干燥处理能增强抗冻性。一般用真空干燥法进行干燥，干燥后投入液氮保存。,5贮存从理论上讲，只要保证不断补充液氮，就可以长期保存冷冻的材料。但是有文献报道，随着时间的延长，冷冻茎尖的生活力下降。,6解冻贮藏于液氮中固定样品，缓慢升温时，细胞内会再次结冰，危险区大概在-50-10度。实验表明，冰冻过的材料在3540度水浴中解冻比在室温解冻效果好。冰冻的材料细胞很脆弱，解冻时应避免剧烈摇动。,7解冻后的处理解冻后残留于细胞的冰冻保护剂会影响材料的恢复生长，所以需要除去保护剂；但是没有必要连续洗涤，多次洗涤对细胞的伤害往往会更大。,8解冻后活力测定再培养；FDA染色；TTC染色：检测细胞内脱氢酶活性,人工种子,体细胞胚与人工种子,体细胞胚是由植物体细胞培养产生的类似于合子胚的结构；把离体培养产生的体细胞胚或能够发育成完整植株的分生组