几种酶的测定方法.doc

4.3 测定指标及方法4.3.1 芽长、根长、发芽率及生根率选取发芽的种子测量芽长和根长，取平均值。发芽率:发芽率（%）=n/N*100(n为发芽种子数，N为供试种子总数）。4.3.2 淀粉酶测定 采用3，5-二硝基水杨酸法测定540nm处麦芽糖的吸光度变化来得出淀粉酶活力119。1）、称取1g小麦在研钵里研磨（加入数克石英砂），再加入4 ml 1%氯化钠溶液，再用1%氯化钠溶液洗净该研磨物洗入10ml离心管里，在3000转/分钟 的转速中离心10 分钟。再将上清液倒入100ml容量瓶，再用磷酸缓冲溶液定容，即可制备各培养皿的酶溶液。2）、取酶溶液0.5ml放入试管中,置于40摄氏度恒温保温15分钟，再加入40摄氏度预热的1%淀粉溶液2ml,保温5分钟，取出后向各试管加入4ml 0.4 mol/L氢氧化钠溶液，振荡均匀后再加2ml DNS 试剂。3）、将各试管置沸水煮沸5分钟，加蒸馏水定容至20ml。4）、最后，用可见分光光度计在540nm下测定各试管的吸光值，从而计算出各试管的酶活量。4.3.3 丙二醛含量的测定于532nm和600nm波长下测定光密度，计算丙二醛含量120。（1）酶液提取称取萝卜叶片lg放入研钵，加少许pH7.0的磷酸缓冲液和石英砂，研磨成匀浆，移人50ml容量定容。再从其中取出一部分离心，上清液即为酶液备用。吸取3ml酶提取液放入刻度试管中，加入5ml 0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液，在沸水浴上加热10分钟，迅速冷却，以4000转/分离心10分钟。取上清液在532nm和600nm波长下，测定光密度（以不加酶液的对照调零）（2）结果计算A 反应液总量（4ml）；V提取液总量(5m L)；a测定用提取液量(1.5m L)；W 植物样品重量(g)；1.5510-1 丙二醛moll-1的消光系数。）4.3.4 脯氨酸的测定 在酸性条件下，茚三酮和脯氨酸反应产生稳定的红色产物，该物质的最大吸收峰是520nm，脯氨酸含量用酸性茚三酮法测定121。（1）绘制脯氨酸标准曲线，配制脯氨酸溶度为l00g/ml的母液。取母液0.0、0.5、1.25、2.5、5.0、12.5、10.0ml分别放入7个50m1容量瓶中，再分别加入蒸馏水定容至50ml，配成0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0ug/ml的溶液。分别取上述各溶液2ml，加入已编号的7个试管中，再分别加入2ml酸性茚三酮试剂、1ml冰醋酸、1ml 3磺基水杨酸溶液；摇匀之后，在沸水浴中显色30分钟，取出后冷却至室温，向各管加入2ml甲苯，充分振荡，以萃取红色产物。萃取后静置，使红色物质转入甲苯层；用滴管轻轻吸取红色的溶液于比色杯中，在分光光度计520nm波长处测定吸光率；以脯氨酸含量和吸光率绘制标准曲线。（2）游离脯氨酸的提取：称取0.10.5g小麦，剪碎后放人具塞试管中，加5m1 3磺基水杨酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10分钟，过滤液待测，也可直接吸取提取清液测定。（3）游离脯氨酸曲测定取提取液2mI于具塞试管中,加入1ml水、1ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮试剂，摇匀后在沸水浴中加热显色30分钟，取出后冷却至室温，加入2ml甲苯，充分振荡，以萃取红色产物。再静置使其分层，待完全分层后，吸取甲苯层，于分光光度计520nm波长处测定吸光率。（4）计算样品中脯氨酸的含量C由标准曲线查得脯氨酸g数；V提取液总体积（ml）；a测定液体积（ml）；W样品重（g）4.3.5 过氧化物酶活性的测定采用愈创木酚法测定过氧化氢酶（POD）活性122。（1）酶液提取：取小麦2g，剪碎置于研钵中，加5mL 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.5），研磨成匀浆，以4 000rpm 离心5min，倾出上清液，必要时残渣再用5mL 缓冲液提取一次，合并两次上清液，保存在冰箱（或冷处）备用。（2）取光径1cm 比色杯2 个，向其中之一加入上述酶液150ul（如酶活性过高可稀释之），再加入2ml0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）0.5ml0.75%H2O2,0.5ml0.25%愈创木酚，立即开启秒表记录时间；而向另一比色杯中加入0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0），作为零对照。用分光光度计在470nm 波长下测定反应5min 时的光密度值。（3）结果计算以每分钟光密度变化（以每分钟OD470nm变化0.01 为1 个活力单位）表示酶活性大小，即：过氧化物酶活力 =Vt/(0.01WVst)：反应时间内吸光度之变化Vt：提取液总体积W：叶片质量t：反应时间Vs：测定时用酶液体积4.3.6 过氧化氢酶活性的测定 在pH7.7条件下，从样品中提取过氧化氢酶，在提取液中加入一定量的过氧化氢，使过氧化氢在过氧化氢酶作用下分解，再用1.0mol/L高锰酸钾溶液滴定过量的过氧化氢，根据高锰酸钾溶液的消耗量计算出试样中过氧化氢酶活动度123。（1）高锰酸钾标准溶液配制和标定：称取6.6g高锰酸钾，溶于1050mL水中，缓慢煮沸15min，冷却，于暗处放置两周，用已处理过的4号玻璃滤埚过滤，贮存于棕色瓶中。称取0.25g草酸钠，溶于100mL硫酸溶液中，用配置好的高锰酸钾溶液滴定，反应液温度应保持在60左右，继续滴定至溶液呈粉红色，并保持30s。同时做空白试验。高锰酸钾标准滴定溶液的浓度c(1/5KMnO4)，数值以摩尔每升（mol/L）表示按公式（3.2.1）计算： . (3.2.1) 式中：m草酸钠的质量，单位为克（g）；V1高锰酸钾溶液的体积，单位为毫升（mL）;V2空白试验高锰酸钾溶液的体积，单位为毫升（mL）;M草酸钠的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）。（2）测定方法酶液提取：称取小麦lg放入研钵，加少许pH7.0的磷酸缓冲液和石英砂，研磨成匀浆后，移人50ml容量定容。再从其中取出一部分离心，上清液即为酶液备用。测定酶活性取4个三角瓶编号，1、2号瓶备加1ml煮沸酶液为对照，3、4号瓶分别加入酶液1ml，再向各瓶分别加入1H2O22.5m1。置于30水浴上保温10分钟，立即向各瓶加入1H2SO42.5ml终止酶反应。用标定过的0.1mol/L KMnO4滴定剩余的H2O2至粉红色在半分钟内不消失为止。求出1、2号和3、4号瓶的平均滴定值。酶活性计算被分解的H2O2量（mg）=对照滴定值(ml)-样品滴定至(ml)KMnO4的浓度1.7mg（3）结果计算： 过氧化氢酶活动度X按下式计算： (3.2.2) 式中：X过氧化氢酶活动度（以干基计）单位为毫克过氧化每克（mg H2O2/g）;V0空白实验用