华理分子生物学实验.doc

曲霉脂肪酶编码基因的克隆与表达分析接入载体为pET-28a，外源基因为AFL-1，PCR产物直接酶切（NdeI/BamHI）后纯化连接pET28a外源基因信息：/gene/?term=3504452 AFL1-1（Gene ID=3504452）序列信息统计如下： 1 atggcttctc caattctgcg atcaccgatt acttcggacc tcgccaacgt aacacccgat 61 ttggtggatg ttagcactcc cgaaaaattg aaatcctacc gcgaatcact tgaaccaatc 121 ttcactttgg agaatatcat ccgagggaaa gagaacatca tctcctacga ggaactggac 181 atcccaggcc ccgcaggacc gatgcgggcc accatcttcc gccccaagca ccaaacccac 241 cctatcgatg aaatccctgg tatcctacac atccacggcg ggggcctcgc cacgggaaac 301 cgcttcctgg gcttcaccat gctcgactgg gtcgagtccc tcggtgccgt ctgcctgacg 361 gccgagtacc gtctcgcccc ggaacatcac cagcccgccc agctggaaga cagctacgcc 421 gcgctgcagt ggatgagcga ccacgccgcc gagctgggct tcaacccgcg caagctggtt 481 gtctgcggta gctcggcggg gggcaatctc acggcggggg tcaccttact cgcgcgggac 541 cgctcgggcc cgcaaatccg cggccaggtg ttgatctatc cgtgggttga cgatggcatg 601 gactacgtgt ccatgcggca gtatgcggat attgcgcctg tgagggacgt ggacgccgcc 661 gtgttggcta attatgcgtt tggcgagagg cgcgagcacg cggatatgta tactgtgccg 721 atgcgcgcga cgaatttcgc gggcttgccc ccgacgttta tcgatgtggg tgaggcggat 781 gtgtttcgtg atcaggatat cgcgtacgcg tcggctttgt ggaaggatgg tgtctcgact 841 gagttgcatc tgtggccggg cagttggcat gggtttgatg tctttgttcc tgatgctccc 901 attagtcggc gggcgagggc tgctcggttg gaatggcttc ggaagttgtt aagtgtgcct外源基因PCR扩增引物序列：P1: 5GCGCGGCAGC CAT ATG GCT TCT CCA ATT CTG CGA 3P2: 5GCTCGAATTC GGA TCC AGG CAC ACT TAA CAA CTT CCG AAG 3N端保留了标签，用于亲和层析实验流程安排第一天 外源基因的制备涉及实验：PCR、酶切、电泳、回收掌握实验原理：PCR及基本要素和注意点、酶切、电泳、回收实验顺序：PCR扩增-电泳-纯化-酶切-电泳-割胶及回收-载体接种进度限制点：PCR为统一开机，需要所有同学完成后进行 上交样品：外源基因回收样品，标记好组号外源基因的PCR制备体系1#2#总体积 50ml50mlddH2O 35ml34ml10buffer5ml5mldNTP（2.5mM）4ml4mlP1（5pmol/ml）2ml2mlP2（5pmol/ml）2ml2ml模板DNA1ml2mlTaq酶（5U/ml）0.25ml0.5mlPCR反应条件：退火温度61度30s，延伸时间1min。 预变性：95度，5min， 变性95度，30s， 退火61度，30s， 延伸72度，1min， 30循环。 延伸72度，10min， 4度保存。或取出实验，或取出后-20度保存。PCR回收样品的酶切体系总体积ddH2OPCR回收产物BufferNdeI/BamHI40ml15ml20ml4ml0.6+0.6ml酶切反应条件：37度水浴保温30 min。PCR产物纯化：产品说明书DNA片段回收：胶回收试剂盒说明书思考问题：1. PCR中的退火温度和延伸时间如何确定？产物浓度不高的原因？2. PCR实验中如果出现无产物，该如何分析原因？3. PCR扩增产物如果保证其准确性？如果出现扩增基因点突变时，有何解决方法？4. 电泳中针对300 bp和5.6 kb的片段，胶浓度如何选择？5. 胶回收过程中出现无产物带时，如何选择原因？第二天 载体质粒的制备涉及实验：质粒抽提、酶切、电泳、回收、连接掌握实验原理：质粒抽提、连接及体系确定实验顺序：抽提质粒-电泳-酶切-电泳-割胶回收-电泳-连接-感受态接种进度限制点：均为各组独立实验，无限制点 上交样品：载体质粒（P）、载体酶切片段（F）、连接样品（L），标记组号质粒提取：产品说明书载体质粒双酶切Total40 lddH2O34-X l10buffer4 l质粒DNAX l NdeI/BamHI1+1 l酶切反应条件：37度水浴保温30 min。正常情况下，全做酶切。（因回收后条带较淡）连接体系10Buffer载体片段外源片段T4 DNA连接酶15 ml1.5 mlX mlY ml0.5 ml连接反应条件：4度水浴保温过夜。思考问题：1. 质粒的拷贝数通常有哪些？对于低拷贝质粒的制备该如何进行？2. 未酶切的质粒正常带型是如何分布的？如出现异常现象该如何处理？3. 双酶切如发生酶切不完全时，产物带如何分析？在电泳中如果观察？ 4. 重组质粒构建中外源和载体的投入量如何确定？针对不同粘性末端的DNA片段连接该注意什么？5. 大体积酶切（如1ml体积，DNA量为毫克级）该如何设计酶切体系和酶切时间？第三天 转化与RNA抽提涉及实验：感受态细胞制备、转化、RNA抽提掌握实验原理：细菌细胞感受状态、转化、细菌RNA抽提实验顺序：翻瓶(7:30)-感受态细胞制备-RNA抽提-转化-RNA样品电泳-涂板进度限制点：冷冻离心和操净台公用上交样品：涂布平板2块/组，统一放置37度培养箱大肠杆菌感受态细胞的制备1. 用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上，37下隔夜培养。2. 挑取单菌落接种于30ml LB液体培养基中，37下隔夜培养。3. 按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30ml LB培养基中。4. 在37的水浴摇床中培养1.5小时，OD600接近0.5。（以上步骤教师完成）5. 4，6 000 rpm 离心10分钟收获菌体。 1.0ml/管，4管/组6. 上述菌体沉淀用100 ml/管的100 mmol/L CaCl2（冰冻）悬浮，并合并于一管，4 , 6 000 rpm离心10分钟。7. 弃上清，将沉淀用100 ml的100 mmol/l CaCl2（冰冻）重新悬浮。8. 冰水浴中放置3-5h放可使用。RNA抽提：产品说明书大肠杆菌的转化1. 取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。2. 在90 ml感受态细胞悬浮液，加入6 ml DNA连接溶液，轻轻混匀，在冰水浴中放置30分钟。3. 混匀，42水浴中脉冲2分钟，快速转移至冰水浴中，加入900ml LB培养基，37摇床培养11.5小时。（42热脉冲前混匀菌体）4. 吸取适量已转化的感受态细胞涂布于100mg/ml 卡那霉素的LB平板上。（涂布量确定？本次实验离心后弃上清850ml，离心条件4，6000rpm，5min）5. 37下倒置培养1216小时后计数。思考问题：1. 大肠杆菌转化除了感受态细胞转化方法外，还有哪些方法？2. 细菌RNA的半衰期特点？如何判断RNA的抽提质量？3. 抽提RNA过程中为何要带手套和口罩？常规DNA电泳可以分析RNA抽提质量否？4. 转化子筛选原理？一般筛选中还有哪些方法？5. 转化完成最后筛选平板上几乎没有转化子，转化失败可能的原因有哪些？第四天 重组子鉴定与转录水平的表达分析 涉及实验：转化计数、单菌落接种、菌落PCR、RT-PCR掌握实验原理：转化子与重组子、RT-PCR实验顺序：菌落接种（Eppedorf）-RT-PCR-电泳-菌落PCR-电泳-接种进度限制点：PCR为统一开机，需要所有同学完成后进行上交样品：接种重组子的试管1根/组，统一放置37度摇床培养逆转录体系（电子产品说明书RR037A）5Buffer (含dNTP)Enzyme MixOligo dTRandom 6mersRNARNA Free dH2O10 ml2 ml 0.5 ml0.5 ml0.5 ml1 ml5.5 ml对照5Buffer Enzyme MixOligo dTRandom 6mersRNARNA Free dH2O10 ml2 ml0 ml0.5 ml0.5 ml1 ml6 ml逆转录反应条件：37 15min 85 5 sec PCR体系：逆转录组对照组总体积 20ml20mlddH2O 7ml7ml2MIX10ml10mlP1（5pmol/ml）1ml1mlP2（5pmol/ml）1ml1ml模板DNA（逆转录溶液）1ml1ml菌落PCR总体积 25mlddH2O 10ml2MIX12.5mlP1（5pmol/ml）1mlP2（5pmol/ml）1ml模板DNA（菌液）0.5ml每组完成4个菌落的PCR鉴定，其中BL21（DE3）和DH5a各两个；PCR反应条件：退火温度61度30s，延伸时间1min。 预变性：95度，5min， 变性95度，30s， 退火61度，30s， 延伸72度，1min， 30循环。 延伸72度，10min， 电泳鉴定。思考问题：1. 逆转录过程中需要注意RNA酶污染情况否？为什么？2. RT-PCR是定性分析外源基因表达情况？如果要进行定量分析外源基因表达情况，如何设定内参？3. 菌落PCR的模板DNA来源何处？为何能直接以菌液模板进行PCR？血液样品可否直接PCR？4. PCR预混液主要包括哪些组份？如进行批量转化子的菌落PCR鉴定，如何实验可以大大节约时间？如果没有购买预混液，可否自行配制？如果进行？第五天 重组菌的蛋白表达涉及实验：重组菌表达、SDS-PAGE灌胶、蛋白电泳掌握实验原理：诱导、SDS-PAGE电泳实验顺序：翻瓶-制分离胶-诱导-制浓缩胶-菌体样品处理-点样电泳进度限制点：菌体培养摇床公用上交样品：无SDS-PAGE分离胶和浓缩胶配制组 分分离胶（ml）浓缩胶（ml）双蒸水1650270030丙烯酰胺2000670（甲叉双丙烯酰胺）分离胶缓冲液（PH8.8）1250浓缩胶缓冲液（PH6.8）50010SDS504010过硫酸铵5040TEMED2.52.5总体积50004000菌体电泳样的制备将菌体均匀悬浮，测OD600，若1，则稀释，离心，弃上清，按照1OD/1ml沉淀中加入100l 1* loading buffer (50水+50l 2*loading buffer)，悬浮，沸水浴5min，离心后，3l 上样。例如：若OD600nm为 0.6，体积为0.5，则所得沉淀中相应加入0.6*0.5=30l 1*loading buffer （15l 水+15l 2*loading buffer）资料复印：上述6页、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒和RNA抽提试剂盒的说明书讲解内容：周一（准备）：移液器使用、实验总体克隆方案、整个实验周期内需要注意的问题（实验的连续性及空余时间的利用、实验的安全、实验报告-总结报告）周二（Day1）：PCR基本原理、基因克隆中PCR的常规难点（模板-DNA、cDNA）、利用基因同源序列进行全长克隆的方法、模板和酶的优化等问题周三（Day2）：质粒抽提的基本原理（碱裂解法、低拷贝大质粒的抽提方法、