分子生物学实验技术.ppt

分子生物学实验,目录,实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取实验三、琼脂糖凝胶电泳实验四、的限制性酶切实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化实验六、PCR基因扩增技术,实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定,一、实验目的,掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提取方法学习使用紫外分光光度法鉴定DNA的纯度，估计相对含量。,二、实验原理,用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分离，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RNase降解核酸，得到纯度较高的DNA样品。根据核酸与蛋白质分别在OD260和OD280有吸收峰分别测定之，比较OD260/OD280比值在1.8附近程度估计纯度，依据经验公式计算DNA含量。,三、实验材料与试剂物品,1.材料香椿（Toonasinensis）黄花苗,2、试剂,提取缓冲液（预冷）SSCRNase液,3、仪器设备,高速冷冻离心机（8-316）制冰机（8-312）紫外可见分光计（8-316）冰箱（-86度在8-312，-20度，4度在8-312）水浴锅电子天平玻璃仪器等,四、实验操作流程,采摘芽苗，洗净剪小段，擦干表面水分放-86度冰箱冻30分钟以上冰浴研磨匀浆（分次加提取液）以下见讲义,五、结果与处理,纯度含量,思考题：影响本实验结果的因素有哪些，要得到高纯度的DNA需要在实验中注意哪些问题？,实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取,目的与要求通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。,2.相关知识及原理,质粒(Plasmid)：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,DNA超螺旋结构,常用的质粒载体,是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18,pUC19(500700,细菌质粒:细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。,严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。,质粒类型：,载体(Vector)：用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。,具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。,抗性基因（Antibioticresistancegene,suchasAmpicillinresistancegene,Kanamycineresistancegene)启始复制子（ori,Originofreplication)；多克隆位点(MSC,Multiplecloningsiteorpolylinker)；标记基因(Markergene,suchasLacZgene)。,载体的结构：,Ampr抗性基因,Ampr抗性基因编码一种周质酶（-内酰胺酶）可特异地切割Amp的-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力,二、实验原理,碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。,DNA是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。,SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。,细菌裂解的方法：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。,提纯的思路,质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA,测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。,DNA浓度的测定：,紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。,3.材料与试剂材料:含有质粒大肠杆菌JM83+。,三、实验仪器、材料与试剂,（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含有质粒的大肠杆菌JM83+、LB液体培养基（三）试剂：溶液I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白SDS线性DNA沉淀，K可中和DNA,溶液1GET缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0。溶液20.2mol/LNaOH,1%SDS溶液3乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)：60mL的5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mLH2OTE缓冲液或水（+20g/mlRNase）:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/L，EDTA，pH8.0,100%乙醇，70乙醇,平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA,四、实验步骤,接含质粒的单菌落于3mlLBAmp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体,加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴30min,12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心10min沉淀超净台中风干沉淀用20uLRTE溶解，-200C保存,注意：用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时;取液体培养液1.5-2ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET)，充分混匀放置3-5分钟;加入200l新配制的0.2mol/LNaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;,质粒小量提取的方法（手工提取）：,加入150l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;用冷冻高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用0.5ml70乙醇清洗一次，12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50l含有20g/mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,B.用分光光度计法定量DNA取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释);蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。,加入DNA稀释液，测定260nm及280nm的吸收值。260nm读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g/ml双链DNA，33g/ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。,记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:dsDNA=50(OD260)稀释倍数以上浓度单位为g/ml,实验三、琼脂糖凝胶电泳,一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。,二、实验原理,DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电；PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。,三、仪器、材料与试剂,（一）仪器（二）材料1.自已提取的质粒DNA2.相对分子质量标准品（三）试剂15TBE储液(PH8.0)使用时稀释10倍成0.5TBE（1TBE也可）。2凝胶加样缓冲液0.2%溴酚蓝，50%蔗糖3.琼脂糖4.10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4保存。用时稀释成5ug/ml的EB。,四、实验操作步骤,琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）.凝胶板的制备加样（加样体积在1030ul）电泳染色结果观察,C.凝胶电泳检测DNA的浓度,0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40分钟。NEB标准分子量片段(1kbDNALadder),1kbDNALadder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按0.5g上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍）：,0.5kb的条带由500bp和517bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。,相关知识,电泳：泳动速度决定于？琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。,影响迁移率的因素,DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。,常用染料,EB:溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。,五、实验结果与讨论,根据观察结果，绘图。分析自提质粒的情况。,实验四、的限制性酶切,一实验目的及背景,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的片段端为，端为。,限制酶的类型,根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。类和类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故类和类酶在基因工程中基本不用。,型酶,型酶就是通常指的限制性内切酶.它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端。正是得益于限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,酶切反应中应注意以下几个问题：,内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量根据内切酶单位和用量而定，通常1u指在适当条件下，1小时内完全酶解ug特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ugDNA对u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；使用时防止操作中对内切酶的污染。,：,作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（1020U/ugDNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。,反应缓冲液：,反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；TrisHCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成种级别的离子强度：低盐（10mMNaCl)中盐（50mMNaCl）高盐（100mMNaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,酶解温度与时间：,大多数限制酶反应温度为，如EcoR,Hind,BamH,Pst等，也有如Bcl需在下进行反应，反应时间根据酶的单位与用量之比来定，原则是酶：=：小时即可，充分酶解。,二、实验试剂,限制性内切酶（和质粒）buffer:50mMTrisHClpH7.5100mMNaCl10mMMgCl2无菌水,三实验方法,按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。DNA10buffer2l无菌水20l内切酶2总体积：25l,将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。Eppendorf管封上封口膜于水管中反应1小时。反应结束后加入4l的10XLoadingbuffer以终止反应。混匀后0.8琼脂糖凝胶上60伏电泳小时。紫外透射仪上检查实验结果。,四结果与分析,记录紫外透射仪上观察到的结果。分析实验结果的成因。问题与讨论：在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？如何选择和限制性内切酶的用量？反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的？,实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化,实验目的,1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。,实验原理,转化(Transformation)是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。,转化中的受体细胞,转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用RM符号表示。,转化方法：电击法、CaCl2、RuCl等化学试剂法感受态细胞处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源DNA分子的受体细胞(Transformant)。,实验原理,实验原理,本实验以E.coliJM83-菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态，然后与质粒共保温，实现转化。因质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。,抗Amp,宿主细菌,含Amp培养基,影响转化率的因素,细胞生长状态和密度。转化的质粒DNA的质量和浓度。试剂的质量。防止杂菌和其它外源DNA的污染。,实验仪器,实验试剂,大肠杆菌JM83-LB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）氨苄青霉素JM83+质粒,实验步骤,菌株活化感受态细胞制备外源DNA的转化,实验步骤,菌株活化1用接种环直接取冻存的大肠杆菌JM83-，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时2挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中，于37培养35小时3将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23小时，到OD6000.30.4,实验步骤,感受态细胞制备4将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置1530min54000rpm离心5min,弃上清6加入0.8ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min74000rpm离心5min,弃上清8加入0.2ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15的甘油在70长期保存,实验步骤,转化9、取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min10、于42水浴90S11、冰上放置2min12、加入800lLB液体培养基于37培养1小时13、将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上14、将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果,对照组,对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。,转化率,统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子