细胞与细胞工程.ppt

细胞与细胞工程,本章目录,第一节细胞概述第二节生物膜的结构与功能第三节细胞的增殖与分化第四节细胞癌变第五节细胞工程,第一节细胞概述,显微镜的发明细胞是生命的基本单位没有细胞就没有完整的生命,300多年前Leeuwenhoek（1623-1723）世界上最早的显微镜RobertHooke（1635-1703）软木中蜂窝状的小格子“细胞”,光学显微镜,一、显微镜与生命科学,细胞是生命的基本结构单位，所有生物都是由细胞组成的,二、细胞是生命的基本单位,三、没有细胞就没有完整的生命（病毒的生命活动离不开细胞）,非细胞形态的生命体病毒病毒已发现3000余种（含40000亚种）包括：真病毒（virus）：DNA或RNA与蛋白质构成的核酸-蛋白质复合体类病毒（viroid）：感染性的RNA构成，发现约20余种朊病毒（prion）：仅由有感染性的蛋白质构成,第二节生物膜的结构与功能,膜的结构跨膜运输溶酶体与疾病细胞骨架系统,一、细胞膜的结构,二、物质的跨膜运输,1、被动运输简单扩散,水的简单扩散（渗透）与人的染色体数量？,主动运输被动运输内吞或外排,溶酶体：包含多种水解酶的小泡，能将酶释放到细胞质中，将大分子物质分解，最终形成可溶的、可弥散的小分子物质。,细胞内的消化系统,三、溶酶体与疾病,1矽肺二氧化硅尘粒（矽尘）吸入肺泡后被巨噬细胞吞噬，含有矽尘的吞噬小体与溶酶体合并，二氧化硅的羟基与溶酶体膜的磷脂或蛋白形成氢键，导致溶酶体崩解，细胞本身也被破坏，矽尘释出，后又被其他巨噬细胞内吞噬，如此反复进行。受损或已破坏的巨噬细胞释放“致纤维化因子”，导致胶原纤维沉积，肺组织纤维化。2肺结核结核杆菌的菌体成分硫酸脑苷脂能抵抗巨噬细胞内的溶酶体的溶菌作用，使结核杆菌在肺泡内大量生长繁殖，导致巨噬细胞裂解，释放出的结核杆菌再被吞噬而重复上述过程，最终引起肺组织钙化和纤维化。,3各类贮积症（storagedisease）：贮积症是由于遗传缺陷引起溶酶体内的酶发生变异，功能丧失，导致底物在溶酶体中大量贮积，影响细胞功能，常见的贮积症主要有以下几类：台-萨氏综合征（Tay-Sachsdiesease）：溶酶体缺少氨基已糖酯酶A，导致神经节甘脂GM2积累，影响细胞功能，表现为精神痴呆，26岁死亡II型糖原累积病（Pompe病）：溶酶体缺乏-1，4-葡萄糖苷酶，糖原在溶酶体中积累，导致心、肝、舌肿大和骨骼肌无力；属常染色体缺陷性遗传病，患者多为小孩，常在两周岁以前死亡。,4类风湿性关节炎溶酶体膜很易脆裂，其释放的酶导致关节组织损伤和发炎。5.休克在休克过程中，组织缺血、缺氧，膜不稳定，引起细胞pH值的下降(约pH5)，酸性水解酶活化，水解溶酶体膜，最终导致溶酶体膜裂解，溶酶体释放，使细胞、组织自溶。在休克时，测定淋巴液和血液中溶酶体酶（酸性磷酸酶、-葡萄糖醛酸酶与组织蛋白酶）的含量高低，可作为细胞损伤轻重度的定量指标。,四、细胞有骨架吗？,细胞质骨架,微丝,微管,中间纤维,微丝,微丝是指真核细胞中由肌动蛋白单体组成的骨架纤维,肌动蛋白单体,微丝的装配,微丝的装配肌动蛋白（G-肌动蛋白）单体形成蛋白（F-肌动蛋白)多聚体装配的条件-在Mg2+和高浓度的Na+,K+中,G则装配成F-在含ATP和Ca2+及低浓度Na+,K+溶液中，F解聚成G,微丝的踏车行为,因微丝（）极组装速度较（）极快，在一定条件下，表现出一端增长，而另一端减短的行为。,微丝的功能,保持细胞形态肌肉收缩胞质环流胞质分裂,细胞的“肌肉系统”,动画演示,肌肉收缩过程,肌肉的肌纤维中包含有许多纵向排列的肌原纤维，肌原纤维由肌小节组成。在每个肌小节中，由肌球蛋白组成的粗丝和由肌动蛋白组成的细丝F-肌动蛋白相互穿插排列，并且依靠粗丝头端的横桥使二者紧密接触在一起。肌肉的收缩是粗丝和细丝发生相对运动的结果，这个过程受Ca的调节，并需要水解ATP来提供能量。肌球蛋白为动力蛋白,动画演示,微管,微管由、微管蛋白亚基组成，二者形成二聚体，是微管装配的基本单位。,微管装配的踏车现象,因微管正（）极组装速度较负（）极快，在一定条件下，表现出一端增长，而另一端减短的行为,微管的功能,维持细胞形态,维持细胞运动及细胞器的运动,组成纤毛、鞭毛、神经突起、中心粒和纺锤体,中间纤维,大小介于微丝微管之间，主要起支撑作用，与与细胞分化、胞内信息传递及基因表达等相关。,结构：由反向平行的螺旋杆状区，及非螺旋化的球形头（N端和C端）组成,角蛋白纤维波形纤维结蛋白纤维神经元纤维神经胶质纤维,中间纤维的类型,第三节细胞的增殖与分化,概念细胞分裂细胞分化细胞衰老细胞淍亡,为什么会有细胞分裂？,一、细胞分裂,无丝分裂,真核生物的分裂,动画演示,二、细胞分化,腿中眼细胞分化眼形成,？,1、细胞分化:成年人全身细胞总数约1012个。细胞种类有200多种。这么多种类细胞均来自一个受精卵细胞,上皮细胞,脂肪细胞,神经元细胞,平滑肌细胞,心肌细胞,正在受精的卵细胞,2、细胞的发育潜能,由一个细胞可能分化发育出多少种细胞？这就是细胞的发育潜能。大致有三种不同的发育潜能：全能性多能性单能性,胚胎干细胞(embryostemcell)：具有分化成多种细胞类型及构建组织的潜能,多能干细胞:具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。,全能性-具有能使后代细胞形成完整个体的潜能的细胞称全能性细胞,全能干细胞：不但可以分化为胚胎发育中三个胚层的全部种类的细胞，还包括分化为胚胎发育所必需的胚胎外组织，如由滋养层形成的胎盘和脐带等。,多能与单能生血干细胞,单能干细胞：眼睛的角膜缘干细胞可自我复制，但只能分化为角膜上皮细胞,多能生血干细胞,多能干细胞维持多能性开关的秘密（2011）：,干细胞FOXP1基因的mRNA的选择性剪切，产生异构体，改变了该基因的DNA结合特性，随后控制了核心转录因子的表达，促进了多能性的维持。同时，抑制了分化所需的基因。,干细胞的有序增殖和分化细胞是生命发生发育的基本特征，用于组织更新与创伤修复。癌细胞是结构、功能不健全的细胞，主要表现在细胞周期异常，分化受阻，灭活抑癌基因、原癌基因激活；细胞接触性抑制生长消失；抗原改变逃避免疫识别。,癌干细胞是起源于癌细胞，不是起源于正常干细胞，治疗癌症不用杀死正常的干细胞。,癌细胞与干细胞的区别：,肿瘤干细胞与正常干细胞的异同,相同点：,均处于未分化状态，具有自我更新新和多向分化潜能，增殖的同时可诱导血管形成;都具有对称分裂和不对称分裂两种分裂方式;具有相似的调节生长的信号通路;两者都具有端粒酶活性和扩增端粒酶重复序列，而人类终末分化体细胞不具有端粒酶活性。,不同点：,干细胞自我更新具有负反馈调节机制，其增殖与分化处于平衡状态，是有序的。而肿瘤干细胞的这种负反馈机制已被破坏，其增殖分化是无序和失控的;与正常干细胞相比，肿瘤干细胞分化成熟能力缺乏，因此肿瘤细胞往往是低分化的;肿瘤干细胞具有积累复制错误的倾向，而正常干细胞可通过多种途径防止这种情况发生;两者某些信号传导通路不同，可作为治疗的靶点，如肿瘤抑制蛋白通路在正常造血干细胞的自我更新和白血病的形成中具有不同的作用途径,3、植物细胞的全能性,对于植物来说，分化成熟的植物体的细胞，仍保持全能性，仍有可能发育成完整的植株。,从单个细胞到愈伤组织到整个植株,胡萝卜,4、动物细胞是如何分化的？,随着分化的演进，动物细胞逐渐丧失其分化潜能。全能性多能性单能性分化成熟的体细胞实际上，动物细胞丧失全能性的过程，开始得很早。,分化成熟的动物细胞已失去全能性。不可能发育成为完整的动物个体。原因何在？,是否因为在分化发育中丢失了一部分基因？抑或是基因组仍是完整的，原因在别的地方?,动物细胞核移植(Nucleartransfer),实验证明细胞核具有发育全能性,多莉（Dolly）羊的诞生说明高度分化的哺乳动物体细胞核也具有发育全能性关键在于细胞质，细胞质中有着决定细胞分化全能性的物质，称为分化决定子。实验证明，细胞质中的分化决定子是RNA。在卵子形成过程中，卵母细胞中含有25万种mRNA，每种约600个拷贝。这些RNA构成母体信息，决定受精卵的发育潜能。,多莉羊实验说明什么？,用一种专门抑制转录的抗生素放线菌素D处理海胆受精卵,使它几乎不能合成新的RNA，可是它仍可把胚胎发育进行至囊胚期。用专门抑制翻译的抗菌素-嘌呤霉素处理海胆受精卵，使它不能从已有的mRNA翻译合成蛋白质，结果受精卵完全停止分化发育。以上实验都证明RNA在启动分化中的重要作用。,三、细胞为什么会衰老？(cellularaging或cellsenescence),人体早衰症,衰老是人们永恒的议题，至今仍是一个迷。,？,人体衰老时，身体各部分功能都发生衰老,一名男子从36岁到75岁味觉丧失64肾小球减少44肾小球过滤率减少31脊神经元减少37神经传导速度减慢10脑供血量减少20肺活量减少44,身体的衰老是以细胞衰老为基础的,体外培养成纤维细胞来自胎儿可传代50次（与供体年龄来自成人可传代20次有关）来自小鼠可传代1428次（与供体物种来自乌龟可传代90125次特性有关）,实验证明，细胞有着明显的衰老过程,早老症病人细胞培养只传代2-4次,细胞衰老的机理是什么？,氧化性损伤：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS-O2-，OH-，H2O2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。O2和羟自由基OH，OH可引发脂质氧化，脂质过氧化首先引起生物膜的损伤，进一步对细胞造成损伤。自由基一旦生成，它们就能不断扩增，发生级联反应。,维生素E是抗氧化剂，可以抗衰老,端粒:为线性染色体末端重复上千次的TTAGGG序列所组成。DNA聚合酶不能完成线性染色体末端DNA的复制。功能防止染色体免遭融合、重组和降解。端粒的长度决定了染色体复制的次数，细胞每分裂一次，端粒会缩短一部分，从而决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”。端粒酶:是一种能延长端粒末端的核糖蛋白酶，主要成分是RNA、相关蛋白及反转录酶，其含有引物特异识别位点，能以自身RNA为模板，合成端粒DNA并加到染色体末端，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生化。端粒酶的激活或抑制会导致细胞永生化或进入分裂终止期。,人的端粒初始长度大约为15kb，大鼠可达150kp,细胞衰老的机理是什么？,端粒与衰老：,基因与衰老：SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）;wrn突变引发早老症.发育程序与衰老:2011年证实衰老调控通路的基因daf-2和daf-16及sea-2基因也参与发育的时间调控，表明发育时间调控通路和衰老调控通路之间是会相互影响的。线粒体DNA与衰老:mtDNA突变积累与细胞衰老有关:线粒体是细胞内产生活性氧自由基（及过氧化物）的主要场所。线粒体DNA突变，导致过多地产生活性氧自由基(ROS)，ROS对生物膜及许多生物分子产生破坏作用，从而引起疾病及衰老。,四、细胞是如何死亡的？,有两种细胞死亡：因环境因素突变或病原物入侵而死亡，称为病理死亡，或细胞坏死。因个体正常生命活动的需要，一部分细胞必定在一定阶段死去，称细胞凋亡(Apoptosis)。,细胞凋亡是一个由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞程序性死亡（programmedcelldeath,PCD）。,细胞凋亡是普遍存在的,变态：蝌蚪青蛙昆虫、卵幼虫成虫,红细胞：分化成熟失去细胞核凋亡,淋巴细胞：95%以上在成熟之前死去，不到5%成熟后只存活一至几天,T细胞杀伤靶细胞的机制之一：T细胞与靶细胞密切接触，激活靶细胞内的溶酶体酶，使细胞溶解。,癌细胞亦可看作是凋亡失控了的细胞。,细胞凋亡和细胞坏死有什么区别？,细胞凋亡细胞坏死ApoptosisNecrosis,细胞变圆,与周围细胞脱开细胞外形不规则变化核染色质凝聚溶酶体破坏细胞膜内陷细胞膜破裂细胞分为一个个小体胞浆外溢被周围细胞吞噬引起周围炎症反应,下载动画演示,诱导细胞凋亡的因素有哪些？,物理性因子:包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿瘤坏死因子（TNF）等,第四节细胞癌变,癌细胞致癌因素癌基因癌的防冶,一、什么是癌细胞？,1、锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面，才能生长分裂。2、血清依赖性：细胞必须具有生长因子，才能生长。3、接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制。4、形态依赖性：细胞成扁平状，并有长纤维网状结构。,正常细胞的四大生物学特征：,1、永久性无终止地生长，涉及到生长控制的改变2、转化性无限制地生长，脱离了生长因子的调控3、转移性细胞获得入侵正常组织的能力，使得癌细胞远离起源的组织，在机体别处新的克隆。,癌细胞的三大生物学特征：,动画演示,癌细胞是由正常细胞转化而来的，这种过程称为细胞的转化。许多化学、物理、生物因子（DNA肿瘤病毒与RNA肿瘤病毒）是动物细胞转变成转化细胞的条件，这类物质称为“致癌剂”。,二、致癌因素有哪些？,三、癌基因与抑癌基因,癌基因（Oncogenes,Onc）？,现在已经知道人体内存在着两大类基因，它们的突变导致癌的形成。这两大类基因是：,抑癌基因（Tumor-suppressors）？,1、什么是癌基因（Oncogenes,Onc）？,致肿瘤病毒的发现-劳氏肉瘤病毒（RousSarcomaVirus），它能引起鸡的癌症。,PeytonRous（18791970）,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1966forhisdiscoveryoftumour-inducingviruses,动画演示,1978年，Bishop和Varmus在正常脊椎动物细胞中发现与src同源性的基因。它是一个酪氨酸蛋白激酶，调控细胞分裂，不会致癌，所以称之为细胞癌基因（cellularoncogene）或原癌基因（proto-oncogene）,J.MichaelBishopHaroldE.Varmus（1936）（1939）,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1989fortheirdiscoveryofthecellularoriginofretroviraloncogenes,2、什么是原癌基因（proto-oncogenes）？,癌基因是最初从病毒基因组中发现，能使病毒感染的细胞致癌。后来发现绝大多数的病毒癌基因都有能在细胞中找到对应的基因，与病毒癌基因相对应的细胞中的这些伙伴基因称为原癌基因（proto-oncogenes）研究结果表明目前已经克隆鉴定的绝大多数原癌基因，其产物（即癌蛋白）均与相应生长及信号转导有关。,3、是什么抑癌基因（Tumor-suppressors）？大约有10种抑癌基因的突变或缺失也是致癌的一种因素,抑癌基因是正常细胞增殖过程中的负调控因子抑癌基因发生功能丧失性突变(隐性突变)，则导致细胞周期失控而过度增殖Rb基因突变导致视网膜母细胞瘤形成P53基因突变将导致细胞癌变或凋亡,小结癌基因和抑癌基因的对比：_癌基因抑癌基因细胞增殖的正调控因子细胞增殖的负调控因子gain-of-functionloss-of-function显性（dominant）隐性（recessive）_,因为癌的发生需要一系列原癌基因和抑癌基因的突变积累，才能完成。从基因突变率估算，这一过程需要相当长的时间，一般十几年到几十年。所以，癌症是一种典型的老年型疾病。,四、癌的冶疗,传统思路是手术、放疗、化疗癌症治疗新方案免疫治疗(Immunotherapy)基因治疗(Genetherapy)抑制癌症促进蛋白的活性抑制肿瘤血管形成,放疗：射线杀死核酸化疗：用碱基类似物替代碱基，使癌细胞吸收，合成的DNA不发挥作用，导致癌细胞死亡,我们还没有真正认识癌，但我们正向它走去！,1、我们正在向癌症逼近（患癌）2、我们正在走向理解癌的发生3、我们正在走向治疗癌症的目标,细胞融合与细胞培养细胞器移植与生物克隆干细胞工程生物克隆的意义,第五节细胞工程,通过生物学、化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，从而产生具有两个亲本遗传性状的新细胞,童鱼世界上第一条没有父母的鱼“鲫鲤核质杂交鱼”,体细胞杂交/细胞融合技术,一、细胞融合与细胞培养,人鼠细胞杂交,注：杂种细胞可以在培养基中生长，但存在人染色体随机丢失现象,组织培养/快速无性繁殖利用植物组织、植物细胞的全能性，进行快速无性繁殖。优点可固定杂种优势免除制种环节对珍贵植物的引种生产具有特别意义举例组织培养法再生兰花；人工种子,植物组织与细胞培养,组织培养,叶肉组织,愈伤组织,新植株,细胞育种诱导突变，筛选新品系、新品种,植物组织与细胞培养,突变与突变体筛选,植物组织与细胞培养,次生代谢产物生成从培养的植物细胞中提取所需的代谢产物。优点比栽培原料作物更易控制最佳生产条件培养物为无菌、无虫材料，能保证产品质量工艺操作较为简单，可减少劳动费用，提高生产力,二、细胞核移植与生物克隆,细胞核移植技术多利羊克隆实验的意义,1、细胞核移植技术,显微操作仪,细胞核移植与生物克隆,细胞核移植与生物克隆,显微操作示意图,细胞核移植技术,多利羊的克隆实验,严密的实验设计精心的操作过程严格的结果检验,细胞核移植与生物克隆,2、多利羊克隆实验的意义,1）理论意义证实分化成熟的动物细胞核仍具全能性。证实细胞质对胚胎发育分化的决定性。,细胞核移植与生物克隆,2）实践意义,80年代初期到九十年代初期这10年内基因工程用于生产蛋白质多肽类药物有很大发展,转基因动物亦已成功,转基因动物提高了蛋白质肽类药物的产量英国罗斯林研究所和PPL制药公司联合，50只转基因羊，已传四代。希望用克隆法生产4000只基因工程奶羊。,细胞核移植与生物克隆,三、干细胞工程,干细胞（StemCell）胚胎干细胞组织干细胞类胚胎干细胞,干细胞工程,细胞替代治疗角膜病、糖尿病、帕金森病组织替代治疗白血病、皮肤、软组织、骨骼等组织病变器官替代无排斥反应的器官移植,组织干细胞(成体干细胞),干细胞工程,胚胎干细胞,胚胎干细胞获得：从胚胎分离细胞在体外培养和建系细胞核移植：通过体细胞核移植到去核的卵细胞，发育成人的胚胎两种方法都要破坏人的胚胎。反对研究人的胚胎干细胞者认为，人的胚胎有生命，应该具有人权，破坏胚胎就是侵犯人权。,类胚胎干细胞（inducedpluripotentcells，iPCs）,干细胞工程,为了打破这种僵局，就迫使人们要探索新的途径，在不触犯伦理、道德和法律的情况下，拿到类似胚胎的所谓全能性的干细胞。,类胚胎干细胞（inducedpluripotentcells，iPC）,（图片来源：JunyingYu）,2007年日本Yamanaka小组和美国的JamesThomson小组分时同时完成了利用人体表皮细胞制造出了类胚胎干细胞。,干细胞工程,干细胞工程,日本的Yamanaka小组将Oct3/4，Sox2，c-Myc和Klf4这四种基因导入来自一位36岁妇女的表皮和一位69岁男性的结缔组织细胞，大约每5000个细胞就能制造一个iPC细胞，这一高效率保证他们在每项实验中都能得到数个细胞系。相关论文在线发表于细胞上。,干细胞工程,美国的Thomson小组从14种基因中选择了4个基因OCT3，SOX2，NANOG和LIN28，其中前两个和Yamanaka小组是相同的。Thomson和同事利用的是胎儿皮肤细胞以及一个新生儿的包皮细胞。与Yamanaka小组相比，这项研究需要1万个细胞才能分离出一个iPC细胞系。相关论文在线发表于科学上。,干细胞工程,