实训三 MS培养基母液的配制、培养基制备及灭菌.doc

实训三MS培养基母液的配制、培养基制备及灭菌一、实践目的通过本实训，学会配制大量元素、微量元素、铁盐、维生素、生长调节剂等培养基母液。通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。通过对培养基和培养用具的灭菌，掌握高压蒸汽灭菌和干热灭菌的一般操作技术。二、实践用具与材料移液管、电炉、PH试纸、培养瓶、标签、铅笔、量筒、烧杯、容量瓶、广口瓶、玻棒、电子天平、托盘天平、棉花、报纸等用具。硝酸铵、硝酸钾、EDTA、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、IAA、BA等药品、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCL、95%酒精三、实践学时与场地10学时，植物组培实验室。四、实践内容（一）三角瓶棉塞的制作棉塞的作用有：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。要求： 形状，大小，松紧适度制作：（1）取一大小适当的纱布，将其中心铺于三角瓶口，任其自然下垂至外壁，用玻璃杯将纱布向瓶内推进，至棉塞所需长度，握住瓶壁及纱布，取适量棉花向内填塞并压紧（2）将棉塞尾部加适量棉花并压紧，使其略大于瓶口，收紧尾部纱布，并用棉线扎进，剪去多余线头和纱布，棉塞制作完毕（3）使用时，再用牛皮纸或二层报纸包扎好（二）培养基母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10100倍的溶液。 优点：（1）保证各物质成分的准确性。 （2）便于配置时快速移取。 （3）便于低温保藏。1、步骤测定各类母液保存容器容量，记录。根据记录设计各种母液所配浓度倍数和制培养基时取用量计算各种药品所需用量称量药品大量元素等大于0.1g用托盘天平称量，微量元素等小于0.1g用电子天平称量。溶解定容写上标签装瓶 将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。注意将易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。（9）冰箱保存。2、母液配方MS培养基配方=见教材MS大量元素母液（10X）称10升量溶解在1升蒸馏水中。配1升培养基取母液100ml。MS微量元素母液（100X） 称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。注意：CoCl26H2O和CuSO45H2O可按10倍量，即025 mgX10=25 mg（100倍量25 mg）称取后，定容于100ml水中，每次取1ml（0.1ml，即含025 mg的量）加入到母液中。MS铁盐母液（100X） 称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。注意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热，并将pH调至5.5。混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。MS有机物母液（100X） 称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。生长调节剂 单独配制，浓度为1-5 mg/ml（书中为0.5-1mg/ml），一般配成4 mg/ml 。溶解生长素时，可用少量05 1N的NaOH (6-BA)或1ML95%酒精(2，4-D和NAA)溶解，溶解分裂素类用05 1N的HCl加热溶解。 配制培养基母液时注意事项： 某些离子易发生沉淀，可先用少量蒸馏水溶解，在按配方顺序依次混合； 配制母液时必须用蒸馏水或重蒸馏水； 药品应用化学纯或分析纯；（三）培养基的制备1.步骤本次实验要求制作培养基数量1L培养基成分用量10X大量元素母液100ml100X微量元素母液10ml1000XCoCl26H2O 母液1ml1000XCuSO45H2O母液1ml100X铁盐母液10ml100X有机物母液10ml蔗糖30g琼脂10g根据制作要求计算培养基各种母液的用量。3、按下列母液的顺序，用量筒或移液管提取母液，放入有一定蒸馏水的烧杯中。4、加入固化剂：称量10g琼脂，溶解，在电炉上不断加温溶液，并不断搅拌，使琼脂熔化。5、加糖：放入30g已称量蔗糖，稍加搅拌。6、加入生长调节物质，激素类型和用量视培养物不同而不同。7、定容：定容至所需升数。8、调整PH值：迅速用PH试纸测试PH，应该在5.8-6.0之间，如过高，则滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。9、培养基分注：趁热将配制好的培养基分注到培养瓶中，每瓶装入20-35ML左右的培养基。分注后立即加盖，贴上标签，注明培养基的名称和配制时间。（四）、灭菌1、高压蒸汽灭菌包扎用牛皮纸、纱布把玻璃器皿和金属器械包扎好。装水先在高压灭菌锅内装入一定量的水，需淹没电热丝。灭菌将装好培养基的培养皿、包扎好的玻璃器皿和金属器械、放入高压灭菌锅。压力升至49kPa时，打开排气阀排冷气，关闭排气阀继续加压至108kPa,锅内温度为12-10C时，保持15-20min，关断电源，自然冷却。贮藏将培养基、器械取出置于30下备用。附：组培的其他灭菌方式u 干热灭菌洗涤将组织培养的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。灭菌把洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中，在150温度下，干热灭菌1小时，或120下2小时。放置灭菌完毕，待冷却后取出。u 紫外线消毒用于空气、操作台表面和一些不能使用其它方法进行消毒的培养器皿（如塑料培养皿、培养板等）的灭菌，方便，效果好，是目前各实验室常用的消毒法。缺点是（1）产生臭氧，污染空气，对身体有害；（2）射线照射不到的部位起不到消毒作用，故消毒时，物品不宜相互遮挡。u 滤过消毒用于大多数培养用液，如人工合成培养液、血清、酶溶液等（这些在高温下会发生变性，失去其功能，必须采用滤过法除菌。一般用液常用孔径0.22um滤膜过滤即可。注意：（1）滤膜用后丢弃，滤器清洗也比较方便，先用毛刷蘸洗涤剂刷洗干净，用自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗，凉干即可；（2）用前再装上一张新的滤膜；（3）消毒时旋钮不要扭太紧，凡与空气接触部位都用纸包装好，以保证消毒时的效果；（4）消毒后，在无菌环境中立即将旋钮扭紧；（5）滤过少量液体时，用一种能安装在注射器上的小滤器，使用相同的滤膜，滤过时把滤过物装入注射器针管内，压出过滤物注入无菌容器中即可