血小板聚集功能.ppt

1,血小板的止血作用及检测,王学锋,上海交通大学医学院附属瑞金医院,2,3,直径2-4um,厚0.2-0.4um,4,星形，圆形，椭圆形，不规则形,5,图19人血涂片示聚集的血小板和嗜酸性粒细胞,6,7,Scanningelectionmicrographofnormalhumanbloodcells(E红细胞G粒细胞L淋巴细胞M单核细胞P血小板),8,血液涂片中的血小板,9,TheNormalIn-SituProcess,FIG1:Normalbloodvessel,Intima/mediawithendothelialcellbasalmembranesmoothmusclecellscollagenfibers,erythrocytethrombocytelumenleukocyte,Hemostasis,10,FIG2InjuredbloodvesselExposureofcollagenAdhesionofplateletsmediatedbyvWFActivationandde-granulationofplateletsAggregationofplatelets,erythrocytenon-activatedthrombocytelumenendothelialcellbasalmembraneactivatedcollagen-boundthrombocytecollagenfiberssmoothmusclecells,Hemostasis,TheNormalIn-SituProcess,11,FIG3Plateletplugstabilizationbyfibrin,lumenendothelialcellbasalmembraneerythrocytesactivatedthrombocytesplugsealingandstabilizationbyfibrinformation,TheNormalIn-SituProcess,Hemostasis,12,一、血小板的结构,13,图22血小板电镜像(1横切面2纵切面3膜4糖衣5线粒体6血小板颗粒7小管系8糖原颗粒),14,15,16,电镜下血小板超微结构：表面结构，骨架系统，细胞器，特殊膜系统,静止相机能相,17,表面结构,18,表面结构,细胞外衣糖蛋白的糖链（血小板膜受体的所在位置）细胞膜蛋白质与脂质开放管道系统的开口,19,Fibronectin,Thrombin,TSP,vWF,Collagen,FibrinogenvWF，Fibronectin,GPIc/IIa,GPV,GPIV,GPIa/IIa,GPIb/IX,GPIIb/IIIa,1.糖蛋白：受体特性,图3.血小板的表面结构模式图2,ICSH,CD42b/42a,CD41/61,CD36,CD49b/29,21,d-granule,a-granule,GPIb-IXreceptor-complex,vonWillebrand-Factor,fibrinogen,GPIIb-IIIareceptor-complex,ReleaseofglycoproteinsvWFfibrinogencoagulationfactors,ReleaseofADPserotonincalciumetc,platelet,PrimaryHemostasis,NormalPlateletFunction,22,d-granule,a-granule,GlanzmannThrombastenia,Bernard-SoulierSyndrome,platelet,Noreleasefromgranules:Graysyndrome(noa-granules)StoragePoolDisease(nod-granules)Secretiondefects(granulesarepresentbutsecretionisinhibited),PrimaryHemostasis,CongenitalPlateletDysfunctions,23,VonWillebrandDiseaseMechanism,PrimaryHemostasis,d-granule,a-granule,GPIb/Ixreceptor-complex,vonWillebrand-JrgensSyndrome,platelet,24,重要糖蛋白缺乏所导致的疾病?,25,生化组成,磷脂酰胆碱（PC）磷脂酰乙醇胺（PE）膜磷脂鞘磷脂甘油磷脂磷脂酰丝氨酸（PS）磷脂酰肌醇（PI）溶血卵磷脂胆固醇糖脂,膜脂质,75%80%,20%25%,2%5%,2.膜脂质,SPH,plateletfactor3,2.膜脂质,图4.血小板的表面结构模式图3,（二）血小板骨架系统和收缩蛋白,.微管Microtubule.微丝Microfilaments.膜下细丝Submembranefilaments,图5.血小板的骨架系统模式图4,28,AandB,二聚体,细丝,微管,微管维持血小板形态,29,骨架系统和收缩蛋白,微丝肌动蛋白细丝及肌球蛋白粗丝,参与血小板收缩活动，伪足形成和释放膜下细丝,（三）血小板细胞器和内容物,1.-颗粒（granule）：P-selectin，PF4，-TG，TSP，Fn,2.致密颗粒（densebody，颗粒）：ADP，ATP,3.溶酶体颗粒（颗粒）：组织蛋白酶D、E、O等,图6.血小板细胞器模式图5,31,细胞器和内容物,血小板活化？,（四）血小板特殊膜系统,图7.血小板细胞器模式图6,开放管道系统：(opencanalicularsystem,OCS)交换通道,致密管道系统：(densecanalicularsystem,DTS),Ca2+,33,FIG4aCellularorganiza-tionofaplatelet,sidecross-view,outermembranesurfaceconnectedcanalicularsystemactinmicrotubulidense(d-)granulesalpha(a-)granuleslysosomesmitochondria,FIG4bEquatorialcross-view,PrimaryHemostasis,ThePlatelet,总结：,二、血小板的活化及其分子基础,36,1.血小板形态的改变2.血小板表面特殊蛋白的表达(GPIIb/IIIa,CD62P)3.血浆血小板特异产物水平增(PF4，-TG，TXA2),(一)血小板活化的表现,37,1.血小板收缩的基础:在活性物质的作用下发生骨架蛋白的收缩,(二)血小板活化的分子基础,RestingPlatelet,ActivatedPlatelet,活化激活剂:throbin、collagen、TXA2、PAF、adrenaline、ADP、Vasopridsin、等,图9.血小板活化示意图,38,2.血小板表面物质表达基础:,(二)血小板活化的分子基础,GPb/a,P-selectin,图10.血小板表面物质表达,39,3.血小板代谢基础（1）能量代谢,(二)血小板活化的分子基础,葡萄糖glucose,糖酵解,丙酮酸,乳酸,三羧酸循环,CO2,图11.血小板能量代谢,（2）膜磷脂代谢,Ca2+,PCPEPI,溶血PC、PE、PI,PIP2,DAG,AA,环氧化酶,PGG2,PGH2,5-HPETE,LTA2,PGI2,TXA2,脂肪加氧酶,Plateletfactor3,前列环素合成酶,血栓素合成酶,secretion,PLC,PLC,PLA2,图12.血小板膜磷脂代谢,血管内皮细胞,41,42,花生四烯酸代谢产物,TXA2收缩血管促进血小板聚集,PGI2舒张血管抑制血小板聚集,43,三、血小板功能,45,1.定义：是指Plt粘附于血管内皮下组分或其他物质表面的能力,(一)粘附功能（Plateletadhesion）,一.粘附功能,vWF,胶原,Adhesion,GPa-a,GPb-,RestingPlatelet,图13.血小板粘附模式图,黏附反应需要条件?,47,1.定义：是指Plt与Plt之间的粘附，是形成血小板血栓的基础，也是血小板进一步活化和参与二期止血、促进血液凝固的保证。,(二)聚集功能（Plateletaggregation）,48,RestingPlatelet,ADP,GP,ActivatedPlateletone,GPb-a,Aggregation,二.聚集功能,a,GPb-a,Fibrinogen,Ca+,图14.血小板聚集模式图,49,DenseGranule,PlateletAggregation,50,血小板聚集功能,定义三个要素GPIIb/IIIa,Fg,Ca2+诱导剂的作用高切变率的条件下,vWF与Fn也参与血小板聚集图7（幻灯）,51,52,2.诱聚剂：低分子物质：ADP、肾上腺素、TXA2、5-HT等。蛋白水解酶：a、蛇毒等颗粒及巨分子：胶原、微纤维等凝集素：瑞斯托霉素等,53,血小板聚集,三种途径ADPTXA2PGG2,PGH2,TXA2PAF,54,血小板聚集,两种聚集波形,55,1.定义：指血小板被机械或诱导剂激活后,Plt、及溶酶体等贮存颗粒中的内容物通过OCS释放到Plt外的过程,(三)释放反应（Plateletreleasereaction）,56,RestingPlatelet,ADP,ActivatedPlateletone,a,三.释放反应,颗粒：-TGPF4TSP致密颗粒：ADP,P-selectin,Ca2+,图15.血小板释放模式图,release,57,58,四.促凝作用,a,Ca,a,a,Fg,a,a,Ca,FIBRINCLOT,PF3,PF3,a-Ca2+,PF3,Coagulation,a-aCa2+,PF3,凝血活酶,图16.血小板促凝作用模式图,60,Trombogenese,SimonsML,DeckerJW.BrHeartJ1995;74:337;KatzungBG.Basic&ClinicalPharmacology,Appleton&Lange,2001,61,血小板的促凝活性,PF3的促凝活性（参与两个复合物形成）接触产物生成活性（CPFA）：胶原、ADP胶原诱导的凝血活性（CICA）：胶原颗粒中的凝血因子释放（FV、Fg、FXI）凝血酶原酶合成：FXa结合位点,62,五.血块收缩功能,图17.血小板血块收缩功能模式图,63,六、维护血管内皮细胞完整性,填充空隙参与内皮细胞再生和修复,总结：血小板功能,1.粘附功能,2.聚集功能,3.释放反应,4.促凝作用,5.血块收缩作用,6.维护血管内皮细胞完整性,65,66,血小板检验,67,血小板生存时间测定（丙二醛法,MDA法）,68,血小板寿命测定还可以有其他方法?,69,Arachidonicacid,Cyclo-oxygenase,Endoperoxidases,MDA,EffectsofAspirin,Inhibition,Cyclo-oxygenase,Endoperoxidases,MDA,70,血小板生存时间测定,缩短血小板破坏、消耗增多ITP、药物免疫性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、脾功能亢进、SLE、DIC、TTP、HUS血栓性疾病心肌梗死、DVT、糖尿病血管病变,71,血小板自身抗体测定,72,血小板自身抗体,血小板相关免疫球蛋白(PAIgG,A,M)血小板蛋白自身抗体(特异性)药物相关自身抗体同种血小板自身抗体,73,血小板相关免疫球蛋白检测,74,PLATELETIMMUNOFLUORESCENCE,patient,donor,eluaat,75,单克隆抗体血小板抗原固定试验(monoclonalantibodyimmobilazationofplateletantigen,MAIPA),76,MoAbincubation+solubilisation,GMELISAplates+labeledantiHumanIgG,substratereaction,Sanquin,77,改良抗原捕获酶联免疫吸附试验(modifiedantigencaptureELISA,MACE),78,MACE,健康人血小板+待测血清,孵育后裂解,加入包被不同鼠抗血小板膜糖蛋白抗体微孔中,79,临床意义增高见于ITP、同种免疫性血小板减少性紫癜、药物免疫性血小板减少性紫癜、恶性淋巴瘤、Evan综合征、SLE、慢性活动性肝炎等动态检测有利于疗效和预后判断,80,血小板黏附试验（玻株柱法）,81,82,血小板黏附试验（玻株柱法）,血小板黏附率（%）=柱前血小板数柱后血小板数100%柱前血小板数问题:柱前血小板数250109/L,柱后血小板数125109/L,黏附率?,83,血小板黏附试验,临床意义增高高凝状态与血栓性疾病降低vWD、巨血小板综合征、血小板无力症、尿毒症、肝硬化、MDS、服用血小板抑制药物,84,血小板聚集试验,85,透射比浊法测定原理,诱导剂,86,透射比浊法测定原理,87,88,89,90,91,92,93,散射比浊法测定原理,诱导剂,94,散射光测定,95,阻抗法,96,阻抗法的优点,直接使用全血其他血细胞同时存在，真正模拟体内生理环境保存全部血小板，避免大血小板在制备PRP时丢失对于脂血标本的检测，可以克服光学法检测时因过于浑浊而影响结果全血电阻聚集仪与光学法相比，检测高凝状态时的血小板功能更为敏感,97,血小板聚集试验,临床意义增高反映血小板聚集功能增强。见于血栓前状态和血栓性疾病。降低反映血小板聚集功能减弱。见于血小板无力症、巨血小板综合征、储存池病、尿毒症、肝硬化、MDS等,98,血小板第3因子有效性测定,99,原理,a,Ca,a,a,Fg,a,a,Ca,FIBRINCLOT,PF3,PF3,a-Ca2+,PF3,Coagulation,a-aCa2+,PF3,凝血活酶,100,血小板第3因子有效性测定,组别患者血浆（ml）正常血浆（ml）PRPPPPPRPPPP一0.10.1二0.10.1三0.10.1四0.10.1,参考值APTT1-APTT25s,101,血小板第3因子有效性测定,临床意义降低见于先天性血小板第3因子缺乏症、血小板无力症、巨血小板综合征、肝硬化、MDS、尿毒症、DIC、AL、再生障碍性贫血以及某些药物的影响等,102,血块收缩试验,103,血块收缩试验,104,血小板膜糖蛋白检测,105,流式细胞仪原理示意图,106,无需分离，快速检测，避免血小板的激活针对单个细胞分析最少的标本处理，避免血小板亚群的丢失测定血小板的活化状态，检查循环血小板反应性,FCM,107,FCM,可以测定膜表面多种受体的变化新单抗，新功能性抗原决定簇检测极高灵敏度，检出仅有1%活化血小板亚群需微量体积标本（约2l），适合于新生儿血小板明显减少标本，也能进行准确的分析无放射性核素污染,108,糖蛋白阳性血小板百分率,GPIb(CD42b)GPIIb(CD41)GPIIIa(CD61)GPIX(CD42a)CD62P(P-Selectin)2%CD632%FIBR5%,95%99%,109,110,111,112,流式细胞仪检测血小板活化,R2细胞群为单个血小板，R3细胞群为聚集的血小板图1a为未加ADP的血小板分布；图1b示ADP活化后的血小板荧光强度、FSC均抬高，R2细胞群明显减少，R3明显增加，直观的表明血小板发生了聚集。并可自动计算出图T3门中血小板占总血小板的百分率，即为血小板聚集率。,113,临床意义,血小板功能缺陷病血栓前状态和血栓病:CD41,CD61,CD62P,CD63,114,FCM与聚集仪测定血小板聚集的敏感性比较,115,血小板活化分析,116,血小板膜磷脂酰丝氨酸和凝血因子,荧光素标记的AnnexinV(PS特异结合),FibFV/VaFX/Xa的单抗+PLT,FCM检测荧光强度,117,活化血小板膜糖蛋白分子标志物,CD41,CD61,CD62P,CD63,118,血小板微粒,活化出芽0.1-1.0um相同结构,119,血浆血栓烷B2（TXB2）测定,原理ELISA临床意义增高血栓前状态与血栓性疾病降低见于环氧化酶或TX合成酶缺乏症、服用抑制环氧化酶或TX合成酶的药物等。,120,11-去氢血栓烷B2（TXB2）测定,原理ELISATXB2在肝脏氧化酶作用下的产物不受体外血小板活化的影响,121,血浆-TG、PF4测定,原理双抗体夹心法临床意义增高反映血小板被激活及其释放反应亢进。降低见于先天或获得性储存池病。,122,血小板功能