益生菌固态生物发酵的研究

中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集 ( 2 0 0 6 年广州) 益生菌固态生物发酵的研究 李巧贤1 ， 包海 泉2 ( 1 . 内蒙古畜牧科学院，内蒙古呼和浩特 0 1 0 0 3 0 ; 2 内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特0 1 0 0 1 8 ) 摘要:目 的: 提高饲料转化率;降低饲料成本的能力。方法: 用饲料发酵基质， 再添加碳源和氮源， 进行多菌种、不同时间、分别接种的方式进行厌氧、需氧固态发酵， 然后效果比较。结果:各试验 组饲料经发酵后其粗蛋白、灰分、磷、钙等指标和饲料消化率都有明显提高，而且有酸甜芳香的味 道 ( 真菌除外) 。 结论:蛋白 含量高的基料对乳酸菌的生长非常有利， 活菌数很高。 而酵母菌、 木霉 菌用于纤维素含量高的麦鼓底物发酵，活菌数也很高，能降低饲料成本。在多种菌发酵时采用不同 时间分别接种的方式，需氧和厌氧不同培养方式， 对产酶活力、 粗纤维利用率及粗蛋白 含量都有影 响。固态发酵分别采用需氧、 厌氧不同方式生产出 来的 益生素饲料添加剂， 使用效果更为理想。 关键词:益生菌;固态发酵:代谢产物 益生菌作为生物兽药已 应用到了实际生产中，它具有良 好的防治消化道疾病和调节体内微生态 平衡、 提高机体免疫力、降低和中和毒素、促进康复等功能。并具有无毒、无害、 无污染、无残留 的 优势。 但常规的生物制品方法使其代谢产物中的氨基酸、维生素、 抗菌肤、有机酸、各种酶系等 没有充分利用， 而固态生物发酵的方法使其菌体、 代谢产物等各组份一道发挥了 更有益的作用。 在 促进生长、增加体重、 提高饲料转化率和生产性能各方面都比液体发酵方式有所提高。活菌数的 提 高尤为明显。 1 材料和方法 1 . 1 菌种来源与培养基 菌种N 8 10 1 % N 9 4 0 4 N N 9 5 0 2 N N 9 6 0 3 , N 9 3 0 1 % N 9 3 0 8 ，由内 蒙古畜 牧科学院 提供( 经中 科院 微生 物所鉴 定) ， 分别为:长双歧杆菌动物亚种、 双歧杆菌动物新种、 植物乳酸杆菌、 短乳杆菌、 粪链球菌、 酵 母菌。 培养基用自 制的液体L Y T . 1 . 2发酵基料与接种方式 固态发酵基料采用全价饲料、玉米、豆饼、数皮分别单独发酵。 全价饲料的发酵分别设有空白 对照组，双歧杆菌组、乳酸杆菌组、粪链球菌组、酵母菌组。发酵之后测定各组的干物质、中性洗 涤纤维、酸性洗涤纤维、 粗蛋白、灰分、 磷、 钙和淀粉的含量，以 进行比 较。 S O g 基 料 + 7 0 % 水 + 5 % 糖 一 灭 菌 一 5 % 接 种 菌 量( 1 0 9 c f u / m L ) 表 1 发酵全价饲料的营养成分变化 千物质( % _N D F ( % ) A D F ( % )C P ( % )灰份 ( %)P ( % ) C a ( % )淀粉 ( %) N 8 1 o l 9 4 . 7 25 5 . 4 21 1 . 1 91 6 . 9 45 . 8 10 . 6 81 . 1 71 9 . 4 9 N 9 4 0 4 9 7 . 3 85 1 . 4 51 0 . 4 51 6 . 3 66 . 4 30 . 6 60 . 9 02 2 . 5 8 N 9 5 0 2 9 4 . 6 25 7 . 0 21 0 . 2 61 8 . 1 06 . 4 30 . 6 51 . 1 01 1 . 4 0 N 8 6 0 3 9 4 . 6 75 6 . 5 01 0 . 7 61 6 . 7 56 . 9 40 . 6 41 . 1 91 7 . 8 3 N 9 3 0 1 9 4 . 7 25 5 . 0 71 1 . 4 01 6 . 2 76 . 1 30 . 6 40 . 7 21 4 . 8 3 N 9 3 0 9 9 4 . 3 25 4 . 7 01 1 . 2 71 7 . 0 46 . 7 50 . 6 91 . 2 41 8 . 7 4 对照8 8 . 7 62 2 . 2 4 7 . 1 01 6 . 0 75 . 7 10 . 5 40 . 3 45 6 . 0 5 1 . 3 菌数测定 中国 畜牧兽医 学 会动物微生态学分会第三 届第 八次学术研讨会论文集( 2 0 0 6 年广州) 活菌计数分别采用选择培养基: B M用于双歧杆菌、 L B S 用于乳酸杆菌、 K F 用于粪链球菌、 S B 用于酵母菌， 分别梯度稀释1 0 1 . 1 0 1 . 1 0 9 . 1 0 1 0等4 个稀 释度; 用0 .2 m L 分别接种， 每个稀释度 接种3 个平皿， 厌氧或需氧培养4 8 h 计数，当每个平皿菌数小于 1 0 或大于3 0 0 时， 应重新调整稀释 度。最后活菌计数: 活菌总 数( c o g ) 三个平皿菌落数之和 . 一X Sx 最后稀释度 表2 固态生物发酵饲料活菌计数 ( c f u / g ) 菌种 N 8 1 0 1N 9 4 0 4N 9 5 0 2 I N 8 6 0 3N 9 3 0 1 I N 9 3 0 9 全价 祠料 2 . 0 5 卜0 9 8 . 0 0 E + 0 8 1 . 0 1 E + 1 0 9 . 5 0 E + 0 8 3 . 1 2 E + 0 9 5 . 5 0 E + 0 8 1 . 0 8 E + 1 0 8 . 5 0 E + 0 8 6 . 5 0 E + 0 9 3 . 5 0 E + 0 8 8 . 4 0 E + 0 9 2 . 6 0 E + 0 8 1 . 9 0 E + 0 9 毯 . 6 5 E + 0 9 2 . 3 0 E + 0 9 2 . 1 8 E + 0 8 5 . 9 0 E + 6 9 3 . 4 0 E + 0 8 1 . 6 6 E + 0 9 2 . 2 0 E + 0 8 5 . 7 0 E + 0 7 1 . 1 5 E + 0 7 2 . 2 5 E + 0 7 5 . 0 5 E + 0 7 注: c f u 龟表示每克含活菌数量 1 . 4影响发酵结果的几个主要因素 利用秸秆饲喂反色动物，是内蒙古奶业基地 ( 全国四大奶业基地之一)的重要饲料来源， 每年 需发酵秸秆1 2 万吨. 利用酵母菌分别接种秸秆， 根据接种时间谁先谁后和共同发酵来观察接种时间 和先后顺序及分别与同时接种对S C P . 滤纸酶活、 粗纤维利用率的影响。 表3微生物处理秸秆时几种因素对 S C P ,滤纸酶活、粗纤维利用率的影响 实 验号 因 素结果 酵母菌 种4 中 时间 空白1空白 2S C P (%)捆 纤维利用率(%) F P A (%) 110442 1 . 1 07 2 . 1 12 .0 0 220001 6 . 2 06 9 . 2 32 .4 0 330881 7 . 4 07 0 . 5 03 .3 0 414401 7 . 5 07 3 . 1 01 .6 0 524881 6 . 1 06 8 . 8 00 .0 0 634042 0 . 6 07 4 . 9 02 . 0 0 718082 0 . 4 06 8 . 8 00 . 1 0 828441 7 . 6 07 2 . 1 00 .5 0 938801 6 . 2 06 9 . 5 00 . 1 0 注:1 、生香酵母、 2 、啤酒酵母、 3 、贝氏 酵母和绿色木霉 2结果 。 从表1 可见， 实验组较对照组干物质量稍有增加，中 性洗涤纤维量增加一倍多，酸性洗涤纤维 有所增加， 粗蛋白 稍有增加， 钙增加2 - 3 倍， 磷稍有增加，灰份稍有增加。由此可看出有益菌对改 变饲料成分的变化不大，但都是有益的成分有所提高。 从表2 可见， 一般益生菌的生理、生 化特性研究和活菌量测定都在体外进行， 而且以 液态培养 为 主， 而益生菌在肠道的自 然环境为固 态或半固 态环境， 通过对固态发酵的 活菌数测定可看出， 无 论是双歧杆菌还是乳酸杆菌、粪链球菌及酵母菌都是豆饼组的活菌数最高，可以 看出蛋白 含量高的 底物有利于细菌的繁殖生长。依次是全价饲料、玉米、鼓皮组。只有酵母菌用数皮发酵结果良 好， 近似于全价饲料， 所以真菌在纤维素含量高的底物中发酵是适宜的。只要碳源充足效果即可。需要 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集 ( 2 0 0 6 年广州) 合理地调整碳源和氮源比 例， 各实验组的饲料经过发酵后都有酸甜芳香味道 ( 酵母菌除外) ， 适口 性 好，动物易采食。 从 表3 可见， 先接、 后接、 分开和同 时接， 用厌氧和需氧条件对产酶活力、 粗纤维利用率及S C P 都 有影响， 尽管发酵的目 的是为了 积累菌体蛋白 及微生物代谢产物和酶类、 维生素、 生长因子 等， 不是 单 纯为了 降 解纤维素。但用微生物处理方法的不同 结果 会对纤维素利用率、 粗蛋白 质、 酶活力 有所影响。 用 生 物 制品 的 常 规 液 体培 养 方 法时 ， 双 歧 杆 菌 、 乳 酸 杆 菌、 粪 链 球 菌的 活菌 数 在1 0 9 c f u / m L 左 右， 酵母菌还要低一些。而用固体表面培养收集菌 体，活菌数是最高的， 但这两种方法都不能充分 利用代谢产物和其组份。用固态发酵的方式可将其菌体、 代谢产物、组份一起发挥有效作用。而且 固态发酵可使活菌数大大提高， 尤其是双歧杆菌提高了1 0 倍之多， 其它菌2 - 3 倍。双歧杆菌的代谢 产物和其组分有非常优良的提高免疫功能的作用，在防治疾病方面有卓越的功能， . 即使死菌体也具 有此功能。对双歧杆菌、乳酸杆菌而言，还是底物含蛋白 质高效果好，酵母菌可多用纤维素高的底 物，木霉也有此特点。 固 体发 酵的p H值 在4 .0 以 上， 并 没有 影响 双 歧 杆 菌、 乳 酸 杆菌的 存活 率。 说明 在弱 酸 性环 境 下， 双歧杆菌、乳酸杆菌的耐受性还是较好的，在这种条件下有害菌不易繁殖， 可控制发酵工艺中的 污 染， 但发酵后的 干燥工艺是目 前值得研究的。 粪 链球菌和酵 母菌耐酸能 力更好一些， 酵 母菌在p H 5 左右生长最好。 2 讨论 目 前， 人们高度重视食品安全，因为畜产品 ( 肉、蛋、 奶)中的抗菌素、 化学药物残留 会影响 人类健康水平。由于耐药性的产生和我们与环境的 互利共生、和平共处的生态平衡发生改变，出现 了许多新疾病. 所以科研人员从事用副作用小、 效果很好的微生物制品代替抗生素和化学药品的 研 究， 并 取 得了 很 大 的 进 展。 其中 益 生 菌( p r o b i o t i c s ) 作为 生 物兽 药己 为 人 知， 它 多 采 用的 是 生 物 制 品的常规液体发酵方法，而且为了 提高活菌数， 在施行冻干技术、 保护剂技术和微胶囊化技术，但 是成本较高。作为生物饲料添加剂使用时，即要求能够发挥替代抗生素的作用，又需要降低成本， 所以 应该采用固态生物发酵进行研究。 使用更合理的微生物发酵剂处理秸秆，充分利用废弃资 源，节约粮食， 提高反当动物的 采食量 ( 纤维食物) ， 提高生产性能 ( 多产奶，多长肉) 。目 前的微生物发酵剂的主要日 的并不是降解秸秆 中的中粗纤维， 而是将其处理后产生各种酶系、维生素、 有机酸、乙醇、促生长因子等多种活性物 质使秸秆酸甜可口，易于食入。微生态学科是边缘学科，需要营养学、生物化学、免疫学等学科相 互贯穿，对其与机体相互发生、发展，作用机理等进行长期的探索和研究。 酵母菌是动物生长中 很有益的 微生物，已 知的 酵母菌共有9 5种之多， 使用它发酵过的饲 料营养 价值高，促生长、增体重的作用很好，因为它本身含有6 0 % 左右的蛋白 质，尤其用于反自动物增加 生产性能效果非常好。酵母菌细胞壁中的甘露聚糖能吸附有毒物质和病原菌， 有一定的提高免疫力 和抵抗力的 作用。 与抗生素共用互不影响效果， 所以 它在微生态制剂中 是不可缺少的一员。 .酵母菌 能耐饲料制粒高 温和反当动物瘤胃内的 酸性条件. 酵母菌的 所有代谢 产物对动物都是非常 有益的， 许多的 酶、 激素、 抗菌肤、 抗体、 生长因子都通过基因工程酵母菌生产，而且， 酵母菌还有易培养、 营养要求低，生产成本低