家畜胚胎性别鉴定技术的研究进展

第2 5 卷 增刊 Vo l . 2 5 ，J u p . 广 J o u r n a 西农业生物_ 科_ I o f Gu a n g x i Ag r i c . a n d B i o l . S 学 ci ence 2 0 0 6 年9 月 S e p t . , 2 0 0 6 文章编号:1 0 0 8 一 3 4 6 4 ( 2 0 0 6 )增一 0 1 6 2 一 0 5 家畜胚胎性别鉴定技术的研究进展 付强，张明，卢克焕 ( 广西大学 动物繁殖研究所，广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，广西 南宁 5 3 0 0 0 5 ) 摘要: 性别控制是按照人们的意愿生产特定性别后代的动物繁殖新技术。 早期胚胎性别鉴定是人们实现 性别控制的重要途径。 应 ( P C R ) 技术的应用 随着科学技术的发展和各种新的研究工具在性别鉴定中的应用， 尤其是聚合酶链式反 ， 性别鉴定在生产实践中的应用越来越广泛。 本文综述了胚胎性别鉴定方法的基本原 理和研究概况，并阐述了该技术存在的问题和发展前景。 关键词:性别鉴定;聚合酶链式反应 ( P C R ) ; 胚胎; S R Y基因; 环媒恒温扩增 ( L A MP ) 中图分类号:S 8 1 4 - 8文献标识码:A D e v e l o p me n t o f p r e i mp l a n t a t i o n e mb r y o s e x i d e n t i f i c a t i o n F U Q i a n g ，Z H A N G Mi n g ，L U K e 一 h u a n ( A n i m a l R e p r o d u c t io n I n s t i t u t e ， G u a n g x i K e y L a b o r a t o r y f o r S u b t r o p ic a l B io - R e s o u r c e C o n s e r v a t i o n a n d U t i l i z a t i o n , G u a n g x i U n iv e r s it y , N a n n i n g 5 3 0 0 0 5 ， C h i n a ) A b s t r a c t : S e x c o n t r o l i s r e f e r r e d t o t h e a n i m a l r e p r o d u c t i o n n e w t e c h n o l o g y w h i c h c a n m a k e a d u l t l i v e s t o c k p r o d u c e c e r t a i ns e x d e s c e n d a n t s a c c o r d i n gp e o p l e s d e s i r e . T h e i d e n t i f i c a t i o n o f p r e i m p l a n t a t i o n e m b r y o i s a v e r yi mp o r t a n t me t h o ds e x c o n t r o l . Wi t h t h e d e v e l o p me n t o f t e c h n o l o g y a n d t h e a p p l i c a t i o n o f v a r i o u s n e wi ns t r um e nt， s e x i d e n t i f i c a t i o n i s mo r e a n d mo r e c l o s e r t o c o mme r c i a lp r a c t i c e . p a p e r , t h e p r e s e n t p r o g r e s s o f b a s i c p r i n c i p l e i d e n t i f i c a t i o n o f e a r l y me t h o d s a r e p r e s e n t e d I n t h i s e mb r y oi n ma mma l a r e i n t r o d u c e d . An d t h eq u e s t i o n s a n d t h e me t h o d s o f a n d p r o s p e c t o f t h e s e K e y w o r d s :s e x i d e n t i f i c a t i o n ; P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n ( P C R) ; e mb r y o ; S R Y g e n e ; L o o p - m e d i a t e d I s o t h e r m a l A m p l i f i c a t i o n ( L A MP ) 性别控制是一项显著提高家畜繁殖率的生物技术， 对家畜育种、生产和伴性遗传疾病的防治均有 重要的意义。目前家畜性别控制主要采用两条途径，即精子分离和早期胚胎的性别鉴定。虽然使用流 式细胞仪已 成功分离了X , Y精子， 但其成本高， 分离效率低， 暂时还难以在实际生产中推广。 而牛早 期胚胎的性别鉴定已有几十年的发展历史， 随着胚胎移植技术的产业化推广， 该方法也日 趋发展成熟， 特别是P C R技术的发明和性别决定基因的发现， 早期胚胎性别鉴定成为目 前最具实用价值的一项性别 控制技术。 早期胚胎性别鉴定有多种方法， 大致可分为两类: ( 1 ) 以细胞核型分析法为代表的早期生物 学方法; ( 2 ) 以P C R技术为主的分子生物学方法。 本文就目 前应用于家畜早期胚胎性别鉴定的几种方 收稿日 期: 2 0 0 6 - 0 8 - 2 9 . 签金项目:省部共建国家重点实验室培育基地 “ 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室”开放课题基金 ( S B 0 4 0 3 ) ;广西科学研究与技术开发项目 课题 ( 桂科转0 6 2 6 0 0 1 - 3 - 1 ) , 作者简介:付强 ( 1 9 8 1 一 ) ，男，河南信阳人，广西大学，硕士。 通讯作者: 张明， 教授; E - m a i l : m i n g z h a n g (a g x u . e d u . c n . 增刊付强等: 家畜胚胎性别鉴定技术的研究进展 法作一阐述。 1 早期生物学方法 L1 细胞遗传学法 该方法通过查明胚胎细胞的性染色体类型为x x型或X Y型来判断性别。 其程序一般是取少量胚胎 细胞进行活体组织分析， 利用乙酞甲基秋水仙素 ( C o c e m i d ) 来阻止有丝分裂， 经固定染色， 得到处于 分裂中 期的染色体分布相。 G a r d n e r 等E l l 从囊胚滋养外层上取下部分细胞， 成功确定了兔胚的 性别。 该 方法进行胚胎性别鉴定理论可达到1 0 0 %的准确率， 但对胚胎有损伤， 操作过程比较繁琐， 所需时间长， 不适用于生产实际，目 前主要用来验证其他性别鉴定方法的准确率。 1 . 2 X 一 连接酶测定法 X连接酶法通过测定与X染色体有关的酶的活性的高低来鉴定胚胎的性别。其原理是早期雌性胚 胎的两条X染色体中必有一条失活， 从而保持两性的基因等量。 在胚胎基因组的激活与X染色体失活 之间的短暂时期内， 雌性的两条X染色体都可以被转录和翻译， 雌性胚胎中与X染色体相关酶的细胞 内浓度及活性是雄性胚胎的两倍，以此为性别鉴定的依据。将X连接酶的底物，辅酶和指示剂与早期 胚胎一起孵育， 记录各胚胎着色的深浅并进行分类， 从而鉴定胚胎的性别。 Wil l i a m s 等 z 7 用比色分析测 定了整胚的X染色体相关酶6 - 磷酸葡萄糖脱氢酶 ( G 6 P D H)的活性，总体鉴定率为6 4 0 o , Mo n k 等 3 测定了X染色体连锁酶次黄嚓吟磷酸核糖转移酶 ( H P R T )的活性， 在所检测的1 5 个胎儿中 有1 4 个 ( 9 3 %)与预测性别相符。 这种方法对致密桑堪胚阶段的胎儿应用有困难， 而且不确定X染色 体失活的时间，易将雌性胚胎误判为雄性。 1 . 3 免疫学方法 H - Y抗原是雄性哺乳动物细胞膜上的一种糖蛋白， 在进化中H - Y抗原具有保守性， 无组织器官特 异性， 因此， 小鼠的H - Y抗血清可与其他种类雄性动物的H - Y抗原发生反应， 用此方法成功鉴定出了 牛、羊的胚胎性别。该方法又细分为:细胞毒性分析法、间接荧光免疫法和囊胚形成抑制法。 1 . 3 . 1 细胞毒性分析法 在补体 ( 豚鼠血清) 存在的情况下， H - Y抗体可以与H - Y阳性胚胎结合， 并 使其中1 个或更多卵裂球溶解， 使卵裂球呈现不规则的体积和形状， 阻滞胚胎发育， 这类受影响的胚胎 即为雄性胚胎， 而仍能正常发育的为雌性胚胎。 Wh i t e 等 4 用H - Y单克隆抗体对8 - 1 6 细胞期小鼠 胚胎 进行细胞毒性试验， 鉴定的H - Y阴 性胚胎移植后所生仔鼠8 1 . 1 % ( 4 3 / 5 3 ) 为雌鼠。 王达珍等 s 7 用免疫 学方法制备H - Y抗血清， 通过细胞毒性试验检测小鼠早期胚胎细胞表面的雄性特异性H - Y抗原， 从而 鉴定早期胚胎性别， 雌性胚胎鉴定准确率为8 0 %。 这种方法的缺点在于不但要破坏雄性胚胎， 而且降 低雌性胚胎的成活率，目前较少采用。 1 . 3 . 2 间接荧光免疚法以H - Y抗体作为一抗，以异硫氛酸荧光素 ( F I T C ) 标记的山羊抗鼠Y球蛋 白 作为二抗， 将其依次与胚胎共同 培养时， 雄性胚胎上的 抗体先与一抗结合， 一抗再与二抗结合， ，由 于二抗用F I T C标记， 在荧光显徽镜下显荧光; 而不显荧光的则为H - Y阴性的雌性胚胎。 Wh i t e 等4 用 F I T C 标记的间接免疫荧光法检侧 小鼠 桑格胚和早期囊 胚的 性别， 移植1 5 6 枚显荧光胚胎， 所生雄鼠占 7 8 . 3 % ( 1 8 / 2 3 ) ， 移植不显荧光者所生雌鼠占8 2 . 6 % ( 1 9 / 2 3 ) 。 这是一种非损害性胚胎性别鉴定法， 鉴 定过的胚胎都可存活， 但由于对荧光强度的估计具有很高的主观性， 而且H - Y抗原为弱组织相容性抗 原，产生的抗体特异性不高， 导致鉴定准确率不高。 1 . 3 . 3 囊胚形成抑制法 该法是利用H - Y抗体对雄性胚胎从桑堪胚向囊胚发育过程中，具有可逆性 抑 制的 原 理发 展 起 来的 一 种 早 期 胚 胎 性 别 鉴 定 方 法。 将H - Y 抗 血 清 与 桑 格 胚 共同 培 养一 段时 间， 雄 性 胚胎则被H - Y抗体所抑制， 不能形成囊胚腔， 而无H - Y抗原的雌性胚则不被H - Y抗体所抑制， 可发育 形成囊胚， 从而将雄胚与雌胚分开。 U t s u m i 等1 6 1 用这种方法鉴别胚胎性别， 获得雄性胚胎鉴别准确率 达9 0 %以上， 雌性胚胎准确率达8 0 %以上。经这种方法鉴定的胚胎存活率较高， 是一种比较实用的技 术，缺点在于雄性胚胎被破坏，而且在实际生产中，很难同时获得刚好处于桑堪胚期间的胚胎，容易 将一部分发育迟缓的雄性胚胎误判为雌性胚胎。 广西农业生物科学第 2 5 卷 2 分子生物学方法 分子生物学方法进行胚胎性别鉴定具有准确、高效、快速、可重复性好等优点，使性别鉴定和性 别控制真正进人可操作阶段，目前已被许多研究人员用于家畜的胚胎性别鉴定。当前应用的分子生物 学方法主要包括以下几种:核酸探针法、P C R ( P o l y m e r s e C h a i n R e a c t i o n )法、荧光原位杂交 ( F l o r e s c e n c e I n - s i t u H y b r i d i z a t i o n , F I S H)法 和 环 媒 恒 温 扩 增 ( L o o p - m e d i a t e d I s o t h e r m a l A m p l i f i c a t i o n ，L A MP )法。 2 . 1 核酸探针法 将Y染色体上一段特异D N A片断用放射性或非放射性同位素标记，该D N A探针与胚胎细胞中 D N A的同源序列进行杂交， 并根据显示的斑点来判断是否有Y染色体存在， 从而鉴定胚胎性别。 若结 果为阳性， 则胚胎为雄性， 反之为雌性。 L e o n a r d 等 ; 首次报道用牛Y染色体特异性D N A多重复序列 探针鉴定牛囊胚期胚胎获得成功， 胚胎性别鉴定准确率为9 5 % ( 8 1 / 8 5 ) . B o n d i o l i 等1 8 1 采用同法对牛胚 胎进行性别鉴定， 对1 1 1 枚胚胎进行鉴定， 经冷冻， 解冻后移植， 产犊3 7 头， 其性别准确率为1 0 0 0 0 . 该方法准确率高，但过程繁杂，对每种动物需设计不同的探针，如使用同位素标记还需要较长时间 ( 需低温曝光7 8 d ) ，因而该法还不能广泛应用在生产上。 2 . 2 荧光原位杂交法 ( F I S H) 该方法步骤包括荧光素探针制备， 探针和靶D N A的变性与杂交及观察鉴定。 G i m e n e : 等 9 用F I S H 技术以Y染色体探针和切割胚进行杂交检测猪胚胎性别， 可鉴定率为9 1 0 o ( 8 5 / 9 7 ) ， 移植后出生后代 显示鉴定结果为1 0 0 0 0 。 该方法制备了特异性序列片断探针， 且杂交在细胞内进行， 并能使用试剂而发 光，显色，具有高效、快速和错误率低的优势，但原位杂交有时需要放射性物质，荧光素也对胚胎有 较强毒性， 所以这种方法没有被推广。 2 . 3 P C R鉴定法 P C R是利用耐热D N A聚合酶对特定基因进行体外扩增的技术。 在短时间内将目的D N A片断大量 扩增， 通过扩增产物分析来判断目的片断的存在。 P C R鉴定法是目 前唯一的、常规的、最具有商业应 用价值的鉴定胚胎性别的方法。 这种方法对胚胎损害较小而且不易被粘附在胚胎表面或透明带里的精 子所污染，准确率也较高，可达9 0 %以上，同时还具有快速、简便、经济等优点，被国内外研究人员 广泛应用于家畜， 特别是牛、 羊胚胎的性别鉴定。 利用P C R鉴定性别的实质是Y染色体特异性片段的 检测技术。即根据Y染色体上特异性片段或S R Y基因的部分序列合成引物，用少部分胚胎细胞中的 D N A为模板， 在一定条件下进行P C R扩增反应， 能扩增出目 标片段的胚胎即为雄性胚胎， 否则为雌性 胚胎。使用P C R扩增方法目前已经在牛、羊、猪等哺乳动物上取得了成功。 用P C R法进行胚胎性别鉴定的过程以牛为例一般包括: ( 1 ) 胚胎的获取。 从供体牛回收的鲜胚或 活体采卵体外受精生产的胚胎以及冷冻保存的胚胎都可用来进行性别鉴定。( 2 ) 胚胎细胞取样及基因 组D N A的提取。 借助显微操作仪或手工切例法从牛的桑堪胚或囊胚中分离出小部分细胞提取D N A后 做分析， 而胚胎大部分细胞则保留下来， 用于胚胎移植等目的。 ( 3 ) 引物的设计与合成。 根据Y染色体 上特异基因的序列设计并合成引物。( 4 ) P C R反应。将引物与样品D N A进行P C R反应， 扩增样品相 应的D N A片段。 ( 5 ) 扩增D N A的电泳检测。 扩增后的D N A在琼脂糖凝胶上电泳， 再经澳化乙锭染色 后在紫外灯下检测，出现特异带的为雄性，不出现的则为雌性。 目 前常用的牛胚胎性别鉴定的P C R方法，主要有P C R扩增雄性特异性D N A片段检测法、Z F X / Z F Y基因检测法和S R Y基因检测法等。 2 . 3 . 1 P C R扩增雄性特异性D N A片 段法 1 9 9 0 年， H e r r 等C i o 首先成功建立了牛、羊胚胎性别鉴定 的P C R法， 通过扩增Y染色体特异性多重复序列鉴定了牛、绵羊等家畜胚胎的性别，准确率分别达 9 1 . 6 %和9 6 . 5 写。 随后于1 9 9 1 年从牛桑堪胚或囊胚的滋养层取4 1 0 个细胞， 经P C R扩增后， 其胚 胎性别鉴定的准确率达9 0 %以上。 P e u r a 等 “ 采取了利用P C R扩增3 对引物进行牛胚胎性别鉴定， 其 中一对是牛D N A特异性引物， 该引物扩增雄雌相同， 使样品中胚样是否丢失的检测成为可能。 另两种 增刊 付强等: 家畜胚胎性别鉴定技术的研究进展 引物是牛Y染色体特异性引物， 它们的扩增产物为雄牛特有。 罗应荣等 1 2 用P C R鉴定绵羊胚胎性别并 进行移植试验， 将经过性别鉴定的胚胎移植给8 只受体母羊， 产羔2 5 只， 羔羊实际性别准确率为8 0 0 o , 其中雄性胚胎鉴定准确率为8 7 . 5 ， 雌性胚胎鉴定准确率为7 6 . 5 %。 朱裕鼎等 1 3 参考P e u r a 等设计的 引物合成两对巢式引物， 第一对是扩增牛Y染色体特异多重复序列，第二对是扩增牛基因组多重复序 列， 扩增第一步加人第一对引物， 然后从第一步反应体系中 取出2 u I . 反应液作为模板， 加人第二对引 物进行P C R扩增， 使性别鉴定准确率达到1 0 0 %。 另外， 柏学进 1 4 1 也进行了此方面研究， 构建了富含 牛和绵羊Y染色体文库， 筛选出特异克隆， 并根据其序列分别设计引物， 用P C R分别扩增牛Y染色体 上约1 4 0 b y 的片段， 绵羊Y染色体上约1 3 0 b y 的片段。 对已知性别的牛和绵羊血样进行检测， 均取得 了1 0 0 %的准确率。 A p p a R a o 等 1 5 克隆了 水牛Y染色体上一个雄性特异性序列， 设计引物对8 0 枚水牛 胚胎进行鉴定，准确率为1 0 0 %。应用P C R扩增Y染色体多重复序列具有较高的鉴别率， 操作技术比 较简单，适用性强，但是该方法扩增的是一般较大的重复片段，并且哺乳动物间存在较高互换率，使 鉴定结果可能存在某些不稳定性。 2 . 3 . 2 P C R扩增Z F X / Z F Y片段法1 9 8 7 年， P a g e 等 ， 发现， 在Y染色体上能够编码一种“ 锌指” ( z i n c f i n g e r ) 蛋白质的D N A片段， 称为Z F Y, Z F Y很接近辜丸决定因子， 从而为利用P C R扩增Z F X , Z F Y基因进行性别鉴定提供了基础。 P e i p p o 等 1 7 对马1 7 枚桑堪胚部分卵裂球Z F X / Z F Y基因进行扩 增， 进行酶切表明鉴定率为9 5 0 o 。徐亚欧等 1 8 依据人及小鼠的Z F X / Z F Y基因设计了一对引物， 利用 P C R扩增牛血液D N A鉴定性别， 将扩增片段用P s t I 酶切， 公牛的Z F Y基因P C R扩增片段有两个P c t I 位点， Z F X基因则没有， 所以电泳时前者出现了3 个片段( 4 8 6 b p , 3 5 6 b p , 1 1 2 b p ) 。 该方法需要对扩增片 段做多态性分析， 鉴定过程需要时间较长。 2 . 3 . 3 P C R扩增S R Y片 段法 S i n c l a i r 等 1 9 发现哺乳动物Y染色体短臂上存在性别决定区S R Y基 因。 K o o p m a n 2 0 把S R Y基因转移到雌性小鼠 ( X X ) 胚胎中， 结果小鼠发育成雄性， 从而证明了S R Y 为哺乳动物的性别决定基因。 此后， 人们利用筛选的特异性引物对S R Y基因或S R Y基因的一部分特异 序列进行P C R扩增对胚胎进行性别鉴定的研究就迅速发展起来。 C h r e n e k 等 2 1 利用扩增牛S R Y序列鉴 定1 6 一3 2 细 胞 期 胚 胎 性 别， 可 鉴 定 率 为9 1 % o P a r k 等 ) 利 用P C R 鉴 定8 一1 6 细 胞 期 牛 胚 胎 性 别， 其1 个卵裂球与胚细胞团的鉴定一致率为9 0 %. 1 9 9 5 年， E a s e n 等 2 3 根据猪、 绵羊、 山羊和牛的S R Y 基因同源性设计引物， 用P C R扩增S R Y基因上1 6 3 b y 的区域， 扩增时在S R Y , Z F X - Z F Y双扩增体系 中进行的，可以鉴定牛、绵羊、山羊等家畜和人的性别， 使在同一引物、同一条件下鉴定多种动物胚 胎性别成为可能。我国在胚胎性别鉴定方面的研究起步较晚，但发展很快，取得了长足的进步。曾溢 滔等 2 4 应用P C R技术扩增S R Y序列进行牛胚胎性别鉴定获得成功， 准确率为1 0 0 0 0 。 柏学进等 1 4 应用 P C R技术鉴定牛胚胎性别，移植3 0 头， 妊娠1 1 头，产犊1 1 头，性别鉴定符合率达到1 0 0 。黄淑帧 等 2 s 在利用P C R技禾通过共同扩增S R Y基因和 p 一 酪蛋白基因进行试管牛和试管羊胚胎性别的鉴定， 妊 娠率分别为3 7 . 5 0 o( 牛一3 / 8 )和6 1 . 4 % ( 羊2 7 / 4 4 ) ， 鉴定准确率为1 0 0 0 0 。 赵学明等 a s 对巢式P C R体 系的灵敏度进行优化， 可使用巢式P C R有效扩增1 2 p g的 模板， 且扩增片断为单拷贝片段。 李小英等 z ; 扩增绵羊、山羊和牛S R Y基因片段， 并根据各 珠蛋白基因设计内标引物， 进行体系优化证明该方法能 够有效用于绵羊，山羊胚胎的性别鉴定。 应用S R Y - P C R法鉴定胚胎性别， 快速而准确， 准确率可达9 5 %以上。 经鉴别后的新鲜胚胎的怀孕 率并没有降低， 但经鉴别后再冷冻保存时，其怀孕率则有所下降。此法的局限性是需要从胚胎中分离 出几个至十几个细胞供检测用， 而这一操作比较费时。 同时， 在操作过程中会偶尔损坏或丢失胚胎。 但 最大的问题是外源D N A的污染，应严格操作程序，避免污染导致的错检。 2 . 4 L A MP法 L A MP 法是由N o t o m i 等 a s 建立的全新的胚胎性别鉴定法， 该方法采用能特异识别靶序列的6 个 位点的4 条引物和一种链置换活性的D N A聚合酶 ( 如B s t D NA聚合酶) ，在6 5 0 C左右，进行核酸指 数级扩增， 扩增效率达到1 0 ， 一 1 0 “ 个数量级。 在扩增反应中产生茎环结构， 保证引物与其杂交启动新 一轮核酸扩增， 反应副产物焦磷酸镁沉淀可直接观察到，以判断是否发生扩增， L A MP法优于其他扩 1 6 6广西农业生物科学 第 2 5 卷 增方法的特点在于:( 1 ) 恒温扩增，不需热循环仪;( 2 ) 高特异性，应用6 个区段，4 条引物，并且这 6 个区段的顺序也有规定;( 3 ) 快速高效， 可在3 0 m i n内完成反应;( 4 ) 鉴定方便， 可直接观察结果。 如与终点浊度仪配套使用， 可在2 -3 h内连续完成扩增、 检测、 鉴定整个过程。 应用L A MP法技术鉴 定胚胎性别， 大大缩短了胚胎在体外培养时间。 这种方法需要专门的试剂盒， 价格昂贵， 对D N A污染 反应极为灵敏， 一旦有极少量的外源D N A污染， 就可能出现假阳性结果， 因而使其在实践应用中未能 广泛应用。 3 胚胎性别鉴定存在的问题和前景 哺乳动物性别鉴定的研究， 可以提高预先判定后裔性别的能力， 极大的增强育种计划的经济效果， 在生产上通过胚胎性别鉴定和胚胎移植，可促进优良家畜的繁殖，加快所需畜产品的生产进程，增加 产品质量， 以获得巨大的社会经济效益。目 前， 科学家们已建立了应用P C R鉴定各种动物胚胎性别的 方法，包括牛、人、小鼠、猪等，这种方法简单、快速、准确、经济，并且已经产生了所需性别的后 代。但由于早期胚胎性别鉴定需从胚胎上采取少量细胞，导致性别鉴定的胚胎经冷冻、解冻处理后胚 胎存活率受到影响，因而胚胎移植成功率下降。同时，劣质胚胎的性别鉴定成功率更低，这就制约了 提供预知性别家畜胚胎的商业化进程，因而发展一种更准确且尽量减少对胚胎产生损害的性别鉴定方 法，是研究者今后努力的方向和目 标。随着鉴定技术的不断改进和完善，性别鉴定将会在畜牧业生产 中得到大规模应用和推广。 参考文献: 1 G A R D N E R R L , E D WA R D S R G . C o n t r o l o f t h e s e x r a t io a t f u l l t e r m i n t h e r a b b i t b y t r a n s f e r r i n g s e x e d b l a s t o c y s t s J . N a t u r e ，1 9 6 8 , 2 1 8 ( 3 1 9 ) : 3 4 6 一 3 4 9 . 2 WI L L I A MS T J . A t e c h n i q u e f o r s e x i n g m o u s e e m b r y o s b y a v i s u a l c o l o r i m e t r i c a s s a y o f t h e X - l i n k e d e n z y m e ， g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e J . T h e r i o g e n o l o g y , 1 9 8 6 , 2 5 : 7 3 3 一 7 4 3 . 3 M O N K M, H A N D Y S I D E A H . S e x i n g o f p r e i m p l a n t a t i o n m o u s e e m b r y o s b y m e a s u r e m e n t o f X - l i n g e d g e n e d o s a g e i n a s i n g l e b l a s t o m e r e J . R e p r o d F e r t i l , 1 9 8 8 , 8 2 :3 6 5 一 3 6 8 . 4 WH I T E K L . I m m u n o f l u o r e s c e n t d e t e c t i o n o f a m a l e - s p e c i f i c f a c t o r o n p r e i m p l a n t a t i o n b o v in e e m b r y o s J . T h e r i o g e n o l o g y , 1 9 8 4 , 2 1 :2 7 5 一 2 8 4 . 5 王达珍 郭继彤.免疫学方法鉴定小鼠 早期胚胎性别的研究 J .内蒙古大学学报:自 然科学版， 1 9 9 4 , 2 5 ( 5 ) c 9一1 2 . 6 U T S U MI K, I R I T A N I A . E m b r y o s e x i n g b y m a l e s p e c i f i c a n t i b o d y a n d b y P C R u s i n g m a l e s p e c i f i c ( S R Y ) p r i m e r J . Mo l R e p r o d D e v ，1 9 9 3 , 3 6 ( 2 ) : 2 3 8 一 2 4 1 . 7 L E O N A R D M， K I R W Z E N B A U M尽， C O T I N O T C , e t a l . S e x in g b o v in e e m b r y o s u s in g c h r o m o s o m e s p e c if ic D N A p r o b e s J . T h e r i o g e n o l o g y , 1 9 8 7 , 2 7 ; 2 4 8 一 2 5 6 . 8 B O N D I O L I K R , E L L I S S B , B Y O R J H, e t a l . T h e u s e o f m a l e s p e c i f ic c h r o m o s o m a l D N A f r a g m e n t s t o d e t e r m i n e t h e s e x o f b o v i n e p r e im p l a n t a t i o n e m b r y o s J . T h e r i o g e n o l o g y , 1 9 8 9 ， 3 1 : 9 5 一 1 0 4 . E 9 1 G I ME N E Z C , E G O Z C U E J , V I D A L F . S e x i n g s ib l i n g m o u s e b l a z t m e r e s b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t io n a n d f l u o r s c e n t i n - s i t u h y b r id i z a t i o n口 .H u m R e p r o d , 1 9 9 4 , 9 ( 1 1 ) : 2 1 4 5 - 2 1 4 9 . 1 0 H E R R C M， R E E D K C . Mi c r o m a n i p u l a t i o n o f b o v i n e e m b r y o s f o r s e x p e t e r m i n a t i o n J . T h e r io g e n o l o g y , 1 9 9 1 ， 3 5 ( 1 ) :4 5一 5 4 . 1 1 P E U R A T , H Y U I N E N J M， T U R N N E N M, e t a l . A r e a l ia b l e s e x d e t e r m i n a t io n a s s a y f o r b o v i n e p r e i m p l a n t a t i o n e m b r y o s u s i n g t h e p l o y m e r a s e c h a in r e a c t i o n J . T h e r io g e n o l o g y , 1 9 9 1 ， 3 5 ( 3 ) : 5 4 7 一 5 5 5 . 1 2 罗应荣， 刘云海， 朱化彬，等.应用聚合酶链式反应鉴定奶牛胚胎性别和移植试验 J .中国畜牧杂志，1 9 9 4 , 3 0 ( 2 ) :3 2一 3 7 . 1 3 朱裕鼎， 王大可， 许罕华， 等. 利用P C R技术鉴定牛早期胚胎性别的研究 J . 高技术通讯， 1 9 9 2 , 1 2 : 1 2 - 1 4 . 1 4 柏 学进， 薛建华， 童雅娟， 等. 牛胚胎移植技术开发与应用研究阶段总结报告【 J . 黑龙江畜牧科技， 1 9 9 9 ( 4 ) :1 4 - 1 7 . ( 下转第1 7 1页) 增刊李曦等:猪呼吸道疾病综合征1 7 1 T H A C K E R E L , H A L B U R P GR O S S R F , e t a l . M y c o p l a s m a h y o p n e u m o n i a e p o t e n t i a t i o n o f p o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o m e v i r u s - i n d u c e d p n e u m o n i a J . J C l i n Mi c r o b i o 1 , 1 9 9 9 ， 3 7 : 6 2 0 一 6 2 7 . MA D S E N M L , N E T T L E T O N D , T H A C K E R E L , e t a l . T r a n s c r i p t i o n a l p r o f i l i n g o f M y c o p l a s m a h y o p n e u m o n i a e d u r in g ir o n d e p l e t io n u s in g m ic r o a r r a y s J . 众 ic r o b io lo g y , 2 0 0 6 ， 1 5 2 ( 4 ) : 9 3 7 一 9 4 4 . V A N R E E T H K， V A N G U C H T S， P E N S A E R T M. I n v i v o s t u d i e s o n c y t o k i n e i n v o l v e m e n t d u r i n g a c u t e v i r a l r e s p i r a t o r y d is e a s e o f s w i n e : t r o u b l e s o m e b u t r e w a r d i n g J V e t I m m u n o l I m m u n o p a t h o l ， 2 0 0 2 ， 8 7 ( 3 一 4 ) : 1 6 1一1 6 8 . ，IJFeel -11U工.上 臼ll 1 2 J V A N R E E T HK， N A U WY N C K H, P E N S A E R T M. D u a l i n f e c t i o n s o f f e e d e r p i g s w i t h p o r c i n e r e p r o d u c t i v e r e s p i r a t o r y s y n d r o m e v i r u s f o l l o w e d b y p o r c i n e r e s p i r a t o r y c o r o n a v i r u s o r s w i n e i n f l u e n z a v i r u s : a c l i n i c a l v i r o l o g i c a l s t u d y 1 3 O P R I E S S N I G T, J . V e t Mi c r o b i o l , 1 9 9 6 , 4 8 ( 3 一 4 ) :3 2 5 一 3 3 5 . s y n d r o me 2 0 0 4, 4 1 t o p i g s T H A C K E R E L， Y U S , e t a l . E x p e r i m e n t a l r e p r o d u c t i o n o f p o s t w e a n i n g m u l t i s y s t e m i c w a s t i n g b y d u a l i n f e c t i o n w i t h M y c o p l a s m a h y o p n e u m o n i a e a n d p o r c i n e c i r c o v i r u s t y p e 2 J . V e t P a t h o l ， ( 6 ) :6 2 4 E 1 4 D E S R O S I E R S R . 一6 4 0 . D i a g n o s i s a n dc o n t r o l o f 1 9 9 7 : 3 3 3 sw i ne r e s p i r a t o r y d i s e a s e s C / / P r o c e e d i n g s o f t h e A m e r i c a n As s o c i a t i o n o f S wi n e P r a c t i t i o n e r s ，一3 4 4 . ( 责任编辑梁健) ( 上接第1 6 6页) A P P A R A O K B , T O T E Y S M. C l o n i n g a n d s e q u e n c i n g o f b u f f a l o m a l e - s p e c i f ic r e p e t i t i v e D N A: S e x i n g o f I n - V it r o d e v e l o p e d b u f f a l o e m b r y o s u s i n g m u l t i p l e x a n d n e s t e d p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t io n J . T h e r i o g e n o l o g y ， 1 9 9 9 ， 5 1 :7 8 5一 7 9 7 . P AGE D C, MO S HE R R, S I MP S ON a f i n g e r p r o t e i n J . C e l l ，1 9 8 7 ， E W e t a l . T h e s e x - d e t e r mi n a t i o n r e g i o n o f t h e h u ma n Y c h r o mo s o me e n c o d e s 5 1 : 1 0 9 1 一 1 P E I P P O J , H UH T I N E N M， K O T I L A I NE N T, 1 0 5 e t a l . S e x d i a g n o s i s o f e q u i n e p r e i m p l a n t a t i o n e m b r y o s u s i n g t h e 幻司月 1土，111 rLLL工esL p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n J . T h e r io g e n o l o g y , 1 9 9 5 ， 4 4 : 6 1 9 一 6 2 7 . 徐亚欧， 唐榕. P C R 扩增Z F Y 及Z F X 基因对奶牛的性别鉴定 J . 西南民族学院学报: 畜牧兽医版， 1 9 9 3 , 1 9 ( 1 ) : 1一3 . S I N C L A I R 冬H , B E R T A P , H A W I A N S J R , e t a l . A g e n e f r o m t h e h u m a n s e x d e t e r m i n in g r e g io n e n c o d e s p