麻疹病毒细胞膜受体研究进展

第六届理事会第二次会议盛教学专业委员会2 0 0 6 年会议论文集 关研究工作的开展。基于此策略，研究人员积极开展了C T L保护性表位的研究，并取得了 一定的研究进展。相关研究简述如下: 已 有的 表 位 研 究 结 果 显 示， 病 毒G a g 蛋白 包 含 的 基 质 蛋白( M a t r i x , M A ) 和 衣壳 蛋白 ( C a p s id ,C A ) , P o l 蛋白， E n v 蛋白， 以 及调控蛋白R e v 和S 2 上均有C T L 表位的A-Ae M c G u i r e 等 2 0 研究发现， 用于试验研究的7 批E l 感染马的外周血中的记忆性C T L 对M A和C A 的识别能力最强，分别高达 1 0 0 % 和 8 6 %，这一研究结果提示我们由 3 5 9个氨荃酸组成的 C A和M A蛋白很可能具有在大多数马中刺激诱导C T L的能力:另外，由于在病毒粒子的 全 部 蛋白 中 ， M A和C A所占 比 重 高 达5 8 % ， 且 较 其 它 蛋白 更 为 保 守 【 2 1 ,2 2 ， 因 此， M A和 C A蛋白 变成了 人们筛选C T L 表位的一 个主要关注的 靶蛋白 区。 C h u n g 等【 1 8 通过对靶蛋白 区 合成重叠 肤的办 法， 在M A 和C A蛋白 上定 位了4 个表 位簇 ( E p it o p e C l u s t e r , E C ) 。 这4 个E C可被用于试验研究的相对多数的马的C T L所识别。而其中MH C异质性的8 匹马中， 体内C T L可对E C 2 - 4 识别的匹数，均过半数。该研究结论进一步确定了MA和C A蛋白为 可被不同M H C型的E I A V感染马的C T L 所识别的表位肤所在区。 其中， E C 1 . E C 3 较E C 2 和E C 4 更 为 保守， E C 3 的 被识 别 率又比E C I 高， 所以E C 3 区 域 上的 肤 在 诱导 广 泛保 护性 C T L方面的作用更为引人关注。另外，对前面提到的筛选表位要满足的第二个要求，即表 位 与 其 诱 导 的C T L 要 具 有 高 亲 和 性 。 C h u n g 等 ( 1 6 1 以E C 上 的 肤 为 对 象 进 行 了 研 究 ， 结 果 发 现， 那些己 经较长时间控制了 反复发热， 且无临床症状的马匹， 体内针对E C表位肤的C T L 确实具有很强的识别能力。 该研究也进一步证明了M A和C A蛋白 上的E C区存在可诱导广 泛保护性的C T L的表位肤的可能性。 三、将要开展的工作及意义 有关E I A V保护性表位的筛选， 尽管国外已 做了一些工作， 但并不完善。 基于表位研究 的重要意义，确定可诱导广泛保护性C T L的表位群仍将是今后要继续开展E I A相关研究工 作的一个重要方面。 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主持研制的E I A V减毒活疫苗， 是世界上第一个研制 成功的慢病毒疫苗， 同时也是唯一被广泛使用的慢病毒疫苗。 实验室及实践应用表明， 该减 毒苗不仅能够有效地帮助免疫马抵抗疫苗毒亲本强毒辽毒株的攻击，而且对 E I A V 株， E I A V A r g e n t in a 株 等 不同 亚型 毒 株 也 可产生 较 好的 保 护 作用 疫保护评价表明， 其可对未区分MH C表型的马群针对辽毒产生 W Y美国 。驴胎皮肤细胞减毒苗的免 9 5 %以上的保护能力， 对国 外毒株的 保护能力也可达8 0 % 以 上( 内 部 研究资 料， 未发表) 。 基于减毒苗的广 泛保护能 力， 以该疫苗作为研究对象， 参照国 外有关E I A V C T L 表位研究的已 有结论， 进行保护性表位群 的筛选，可能会事半功倍。 筛选并确定保护性表位群是我们近期要开展的研究工作，在拥有减毒苗的有利条件下， 定 位 保 护 性 表 位 群的 工 作 成 功 的 可 能 性 会 更 大 ， 当 然 要 想 将 所 有 保 护 性 表 位 全 部 筛 选出 来 是 比较困难的工作，我们初步的研究目 标是参考国外的研究结论并结合减毒株的生物学特性， 筛选出一些尽可能被多数M H C 异质性马识别的表位区。 在定位了 这样一些保护性表位区后， 利用这些表位区 进行表位疫苗设计的尝 试，同 时也 会开展.C T L在E I A V感染过程中的作用 模型的分析研究工作。 即将开展的这些工作必将对阐明马传贫的免疫机理， 完善我国具有自 主知识产权的E I A V减毒疫苗建立免疫保护的理论， 起到积极的推动作用;同时， 也将为艾 滋病等慢病毒感染性质疾病的研究和相关疫苗的设计提供参考。 参考文献略 麻疹病毒细胞膜受体研究进展 宋战的，韩文琦，丁壮， 吉 林大学畜枚兽医学院动物重 要病 原与疾病 研究室， 长春，1 3 0 0 6 2 摘 要: 研究病 毒受体对了 解病 毒感染机制、 病 毒病的预防与治疗 病毒分类等都有重要意义.本文以 麻 文献缭述 疹病毒为重点介绍了 病毒受体近年来的 研究进 展， 并 时病 毒受体的 研究 做以简 要介绍. 关键宇:麻疹病毒病毒受体研究方法 病毒受体的研究一直是病毒学研究的热点。 病毒是通过细胞表面受体进入细胞的， 细胞 膜上的碳水化合物、 脂多糖、 蛋白 质等所有暴露于细胞表面的分子都可作为病毒的受体， 一 般来说， 病毒入侵细胞均是通过病毒受体介导的。 病毒与受体结合后其结构发生改变是其入 侵细胞的核心机制。病毒受体可定义为位于宿主细胞表面能被病毒吸附蛋白识别并与之结 合， 从而引起病毒感染的分子复合物， 其本质是蛋白聚糖、 糖蛋白、 脂类或糖脂，大多数属 于蛋白 质。 病毒受体可以是单体也可以是多分子复合物， 具有特异性、 高度亲和性、 结合位 点的 有限 性、 靶细胞部位的 有限 性以 及生 物学效 应【 1 0 自8 0 年代首次分离出粘液病毒和副粘液病毒的受体一唾液酸受体，近十几年来，又分 离出大批病毒受体，如:C D 4分子作为艾滋病病毒( H I V ) 的受体 2 、细胞间粘附分子 - l ( I C A M - 1 ) 和低密度脂蛋白 受椒L D L R ) 作为鼻 病毒 ( R V ) 的 受体 3 ，乙 N旦 碱N受体为 狂犬 病病毒 ( r a b i e s v ir u s ) 受体 4 , 唾 液 酸受 体 为乙 肝 病毒 ( H B V ) 5 受 体等， 这 些受 体大多 参 与细 胞的正常代谢功能。 病毒与细胞表面受体的相互作用是病毒亲嗜性和发生病理的主要决定因 素。 研究病毒和受体的相互作用， 有助于研究设计阻止病毒感染的药物， 也有助于了解病毒 如何进入细胞引 起的病理作用 6 0 一、MV病毒受体 M V属于副粘病毒科， 麻疹病毒属， 为一负链有包膜的R N A病毒， 有两个包膜糖蛋白: m .凝素( H ) 和融合蛋白 ( F ) o 1 9 9 3 年， C D 4 6 被确定为M V E d m o n s t o n 株和H a ll e 株的 细胞受 体 7 。 但最近的 研究又发 现， 分离M V时 所用的 细胞系影响了M V毒株利 用的 受体。 用B 9 5 a 细胞分离的 M V利用了细胞上的一种新的受体信号淋巴细胞激活分子( S L A M，也称 C D w l 5 0 ) 8 o ( 一)C D 4 6 为MV的细胞受体 9 0年代初，人们发现了在宿主中有广泛组织分布的脊橄灰质炎病毒受体，由 此，人们 开始用同样的方法寻找MV受体。对M V受体的确定，其中很关键的一点就是发现了能抑 制M V与宿主细胞结合的单克隆抗体，该单抗可以 和细胞表面的5 7 - 6 7 k D的一种墉蛋白结 合。 这个糖蛋白经免疫纯化后， 对其N 2 末端的氨基酸序列进行测定， 结果发现它为补体激 活因 子成员C D 4 6 。 实验证实: 用表达 C D 4 6 c D N A的 重组 表达载体 转染非 容许鼠 细胞， 则 该细胞可与M V结合;编码M V的F 和H蛋白的重组痘苗病毒感染该细胞，该细胞可表达 MV的这两种蛋白 并有细胞2 细胞融合作用发生; C D 4 6 鼠B细胞可支持MV复制， 产生有 感染 性 病毒 9 o D o r ig ( 1 9 9 3 ) 用另 一 种方 法 也发 现M V的 受 体为C D 4 6 。 这 种方 法 将人一 鼠 体 细胞杂交， 观察其结合MV的能力， 结果发现，只含有人 1 号染色体的细胞能和M V结合， 淋巴细胞标记研究发现可能C D 4 6 为MV受体。MV可与表达人C D 4 6 的仓鼠细胞系结合， 感染的C D 4 6 + 细胞可产生合胞体 和病毒蛋白 及针对C D 4 6 的多 克隆 抗血清能阻止病毒的结 合和感染证实了 上述猜想 1 0 ( 1 1 . 1 , C D 4 6 的结 构与功能 C D 4 6是 一种细胞表面糖蛋白， 是 补体激活调节因 子( R C A ) 家族的 成员， 存在于所有的 有核细胞中。 R C A蛋白 通过与活化的补体成分C a b 和C 4 b 结合，阻止它们沉积在宿主细胞 表面， 从而保护宿主免受自 身 补体的 裂解作用。 C D 4 6 是I 型 跨膜糖蛋白， 分子 质量5 7 - 6 7 k D o 胞外区主要为R C A蛋白 黄型的 短共有重复区 ( S C R s ) . C D 4 6 有4 个S C R s , S C R s 1 , 2 和4 有N 一 联接的糖基。 S C R 2 的 糖基化与M V的结合有关。 靠近细胞膜的位置有一富含丝氨酸 苏 氨酸一 脯氨酸 ( S T P ) 区， 紧 接着是 跨膜区 和一个短的 细胞内 尾巴 。 C D 4 6 的S T P 区 有3 个不 同的 外显子A , B 和C ， 形成一系列的 异构体。 它的 胞内 尾部 有1 6 或2 2 个氨墓酸残荃o C D 4 6 的M V结合区位于S C R s l 和2 。 针对C D 4 6 S C R 1 - 2 的单抗可抑制MV感染， 而针对S C R s 3 - 4 的单抗则没有这种作用。 S C R 1 缺失的C D 4 6 突变体不能与M V结合， 但可完全与C a b 结合。 C D 4 6的MV结合功能和它的补体结合功能是不同的， C D 4 6的配体C a b 主要与S C R s 3 和4 结合， C o b 结合区除S C R 3 , 4 结合外，还与M V结合区S C R 2 重叠【 川。 第六届理事会第二次会议皿傲学专业类员会2 0 0 6 年会议论文集 通过突变、肤图谱及抗体抑制实验证实， C D 4 6 的S C R I - 2 与MV的相互作用主要由以 下的几 个氮 基 酸残墓: S C R I 的G lu 2 4 ; A 呼5 , P r o 3 9 , T y r 6 7 和4 5 - 4 8 a a 及S C R 2 的A s p 7 0 和8 5 - 1 0 4 s a 5 o S C R I 和S C R 2 的 晶 体结 构 显 示， S C R的 每个重复 区 折 成S C R 特有的R 转 角，有2 个二硫键和疏水中心来稳定其结构。S C R I 和S C R 2 的2 个糖墓位于同一侧，覆盖 着整个分子的大部分区域， 这样可阻止该分子与其它蛋白 分子接触。 2 个糖基的末端互相接 近， 糖基及蛋白 质一 糖基的相互作用稳定了蛋白 质的构象。 S C R I 和S C R 2 的2 个片段之间有 一定的灵活性，它们之间可转动 1 5 0 角。在接近病毒结合表面的中心，S C R I 有 1 个疏水的 环 ( L o o p ) ， 这 个 坏 是M V 结 合 的 关 键 位 点 ， 其 边 缘 为P r o 3 9 ， 在 与M V 的 血 凝 素 结 合 中 起 很 大作用，可作为药物设计的靶位点。S C R 2 上的N 2 连接的糖基是M V结合时必不可少的。 糖荃的位里和病毒结合表面不在同一侧， 但糖基与蛋白 质的相互作用可稳定整个受体的构 象。 S C R I 和S C R 2 的晶 体结 构使C D 4 6 和M V的 相互作 用显得更为 清楚 6 川。 2 . C D 4 与1u U的作用 C D 4 6 与M V的作用可引发一系列的细胞内信号反应， 影响M V引起的病毒感染和免疫 抑制的 病理发生。 C D 4 6 的 胞内 尾巴， 尤其是含2 2 a a 尾的异构体2 ( c y t - 2 ) ， 有一个参与细胞 内 信号的 基序， c y t 2 可与s r c 激酶 信号 途径的 成分相互作用【 川。 MW - H和C D 4 6 的高亲合性的相互作用可导致感染细胞表面C D 4 6 的下调， 使得它们对 C a b 介导的补体裂解更为敏感。 该下调作用需要C D 4 6 的尾部，即需要信号级联反应， 并且 只有H蛋白 为4 9 1 t y r M V毒株有这种作用。 M V和C D 4 6 的 相互 作用还可通过信号途径调节 引发抗病毒免疫反应。 它可抑制主要起始细胞免疫反应的细胞因子I L - 1 2 在单核细胞中的表 达。 M V 感染树突状细 胞也可抑制I L - 1 2 的 表达【 川。 另 外， M V与C D 4 6 结 合， 通过c y t - 2 尾引 起细胞内 信号， 产生I F N a I F N在引 发早期的 抗病毒免疫反应过程中起重要作用。 M V以 补体调节蛋白为受体， 可影响宿主细胞的功能， 使 病 毒 逃 避了 有 效的 细 胞 介 导 的 免 疫 反 应。 研 究M V - C D 4 6 的 相 互 作 用， 可 进 一 步了 解 病 毒 选择补 体调节蛋白 作为 受 体的 意 义 1 1 5 。 麻 疹病 毒与 细 胞 表面的C D 4 6 分 子结 合引 起细胞 感染， C D 4 6 分子是活化补体成为C a b , C o b 的 受体。 众所周知， 麻疹感染可导致结 核菌素 反应转为阴性， 细胞免疫功能低下， 从而结核病情恶化。巨噬细胞上的C D 4 6 分子同麻疹病 毒结合后，能 使巨 噬 细胞释放白 细胞介素1 2 的 功能 低下， 可能 是其中 原因 之一【 7 a ( 二) S L A M为MV的受体 S L A M 是最近发现的 M V的受体，是两个实验室几乎同时通过两种不同方法得到的相 同的结论. 用含绿色荧 光蛋白 价F P ) 报道墓因的重组水疤性口 炎 ( V S V ) 来研究M V E d m o n s t o n 株与B 9 5 a 分离株K A株不同细胞嗜性的机制。该V S V缺乏编码V S V G膜蛋白的基因，而 G蛋白参与受体结合和膜结合作用。 这样的假型病毒可利用外源包膜蛋白 进入细胞， 细胞内 为V S V的复 制过程。 V S V可在大部分的 哺乳动物细胞内复制， 可通过观察G F P表达细胞 来评估外源的膜蛋白的病毒与细 胞亲嗜性的关系。 研究表明， MV的H蛋白 在病毒进入细 胞过程中 起重要作用。 含K A 株H 蛋白 和E d m o n s t o n 株F 蛋白 的V S V ( A G - K A H F ) 可感染B 9 5 a 等淋巴细胞系， 但不感染K A株不感染的细胞系。 将B 9 5 a 细胞的c D N A文库分为不同的组， 将这些不同的c D N A质粒D N A转染E d m o n s t o n 株敏感而K A株不敏感的细胞2 9 3 T ，然后 用V S V A 0 2 K A H F 感染2 9 3 T 细胞。在检测的c D 2 N A克隆中，有一组产生G F P 表达细胞。 这组阳性细胞经筛选后，只剩下单一克隆转染的2 9 3 T细胞对V S V A G - K A H F 高度易感。对 这个B 9 5 a c D N A的D N A序列分析显示它与人S L A M在核昔酸水平上的同源性高达9 1 %, 表明人S L A M是K A和其它B 9 5 a 分离M V株的细胞受体。 为 验证S L A M为M V的细胞受体， 将人S L A M基因转染 对M V不敏感的C H O细胞， 则C H O / S L A M细胞对K A株有很大的亲合性。 另外， 用针对S L A M的单抗预处理C H O / S L A M 细胞， 可完全抑制K A株的 感染【 8 。 将M V的H蛋白 截断用杆状病毒表达， 该H蛋白 为溶 于水形式 ( S o 1 H ) ， 它不能 与C D 4 6 结合， 但不影响与淋巴 细胞受体的 结合。 研究结果显示， S o lH与B 9 5 - 8 细 胞的 结合 对胰酶处理敏感， 表明M V的受 体是在细胞表面的 一种蛋白。 通 过对S o 1 H与不同的淋巴细胞系的结合研究表明，M V淋巴细胞受体位于激活或成熟的B和 T细胞上。研究者从已发表的淋巴细胞决定因子和因特网上找到一些潜在的受体，包括 C D 2 5 , C D 3 0 , C D 3 9 , C D 5 4 , S L A M等。 用含B 9 5 2 8 细胞c D N A表达文库的质粒转染不表 文献稼述 达C D 4 6 的细胞C H O ，然后用嗜淋巴细胞M o n t e f i o r e 8 9 株感染。用与磁株相连的H蛋白的 单抗筛选出感染细胞，从感染细胞中分离出质粒。经过几轮筛选，对感染细胞中提取的含 B 9 5 - 8 c D N A的质粒进行序列分析， 发现其与人S L A M的同源性为8 9 %， 与绒猴S L A M的同 源性为 8 8 . 6 %。实验证实，MV可感染编码人或绒猴S L A M的c D N A转染C H O和2 9 3 T a d 细胞 9 ) . 1 . S L A M 的结构 S L A M是免疫球蛋白 超家族C D 2 的成员， 存在于激活的所有T . B细胞和树突状细胞。 S L A M是增强 淋巴 细胞增殖、免 疫球蛋白 合成和分泌I F N 一的 共刺激分子。 S L A M I 多 肤分 子质量为3 4 , 4 8 6 k D ， 两个经剪切的m R N A s S L A M 2 和S L A MS 可编码该蛋白的截断形式与 C D 2 家族的 其它成员 一样， S L A M含有两个高 度糖基化的 免疫 球蛋白 超家 族结构域。 S L A M 有一个 远膜的V结构域和一个近膜的C 2 结 构域， 然后是 跨膜区 和胞浆区 【 1 0 . 为了解受体的功能结构域， O n o 等构建了嵌合分子研究M V受体的功能。人S L A M的 V结构域与不同的跨膜蛋白融合都可作为MV受体， 而含鼠S L A M V结构域的人/ 鼠S L A M 嵌合体不能作为MV受体。表达人S L A M V结构域的可溶性分子可与表达MV H蛋白的细 胞结合，但不能与表达MV F 蛋白或不同相关的包膜蛋白的细胞结合。由此可知，S L A M的 V结构域与M V相互作用，介导M V进入细胞。 O n o 等还构建了以小鼠S L A M为骨架，含 人S L A M的V结构或N 一 末端1 - 6 7 a a 或C 2 末端6 8 - 1 3 9 a a 的嵌合体。 该嵌合体可在细胞表面 表达，但不能作为MV受体。 可见， 人S L A M的整个v结构域才有MV受体功能.用点突 变和合成肤等方法可进一步研究 有M V受体功能的S L A M V 结构域的 氨基酸残基 1 2 1 . 2 . S L A M与MV感染的病理作用 S L A M主要存在于为成熟的胸腺细胞、记忆性T细胞和树突状细胞的表面，与MV感 染后在人体内 主要复制位点如胸腺、 脾和淋巴 结等淋巴 器官相一致。由 子病毒破坏表面有 S L A M的淋巴细胞， 在M V感染时，由于T h l 细胞比T h 2 细胞表达的S L A M多， 对T h l 细 胞的 破坏会导致T h l 细胞向T h 2 细胞转变。 这种转变使免疫反 应由 细胞免疫反 应向 更为 温 和 的 体 液 免 疫 反 应 转 变 。 M y 感 染 引 起 的 免 疫 抑 制 和 淋 巴 细 胞 转 变 。 M V 感 染 引 起 的 免 疫 抑 制和淋巴细胞减少症可能与此有关。 H s u 等认为， S L A M与MV的结合可能引起B细胞的F a s 一 介导的细胞凋亡。 激活的B 细胞受到 破坏产生 抗体。 激活T 细胞， 使其合成I F N - y o S L A M与M V的结 合是否影响信号 系统而间 接影响了 淋巴 细胞的活 化， 还有待进一步 研究【 1 3 。 由 于 激活的 树突 状细胞表面也 表达 S L A M MV可能在免疫反应中改变了抗原提呈过程。 MV与 S L A M 的作用，可能为 MV介导的免疫抑制的主要因素。 需要指出的是， 许多病毒包括H I V 、 单纯疤疹病毒和麻疹病毒都通过多种受体或受体联 令 体 感 染 宿 主 细 胞 。 病 毒 包 膜 糖 蛋 白 与 不 同 受 体 的 多 种 形 式 的 相 互 作 用 可 能 有 利 于 病 毒 进 行 不同组织、 不同细胞的感染。 研究病毒受体对了解感染机制、 病毒病的预防与治疗、 病毒分 类等都具 有十分重要的意义【 1 4 ) . 随着S L A M作为M V受体的发 现， C D 4 6 是否为M V自 然分离 株的受体也有了 争论。 M a n c h e s t e r 等在外周血淋巴 细胞 ( P B M C s ) 中 增殖的M V的 低亲 合力受 体， 针对C D 4 6 的 抗体 可阻止 MV 自 然分离株感染 P B M C s ，但他们也观察到适应了 B 9 5 2 8细胞的病毒株不利用 C D 4 6 l 3 。也有人观察到不表达C D 4 6 的小鼠B细胞，也可被M V感染。 这些数据表明在 激活的淋巴细胞存在另一受体。两个实验室利用不同研究方法得出S L A M是MV的受体。 Y a n a g i 还认为， 在V e r 。 细胞分离M V时， 通常需盲传几代， 这样分离的M V毒株利用C D 4 6 受体是由 于 体外适应的结 构而不是 这些毒 株固 有特性 1 4 . M V受体的 发现为研究M V的 病 理发生及致病机制提供了有效的资料， 许多实验室利用C D 4 6 转基因小鼠 研究MV感染致病 机理， 转基因 小鼠 的 应用为M V的 研究 提供了 一 定的 体内 实 验 证据 1 5 - 1 8 o S L A M为 最近 发现的MV的受体，至今还未见有S L A M转基因小鼠的报道。如果将C D 4 6 和S L A M受体 共表达转基因小鼠或联合应用基因剔除小鼠研究MV的致病机理，会为体内MV的传播、 M V的免疫反应、 评价M V的抗病毒因子及筛选新疫苗提供更多依据。 病毒感染的受体不是单个的蛋白 质是有其生物学意义的。 我们知道单个蛋白 质是比较容 易发生突变的， 但是对于一个蛋白 质复合物中的每一条肤链而言突变一定会受到比较严格的 限制，即不能因为突变导致复合物的结构和功能受到影响。病毒的受体如果是单个蛋白质， 第六届理事会第二次会议盛教学专业委员会2 0 0 6 年会议论文集 很容易突变而不能再识别， 这个病毒就会面临淘汰。 如果病毒的受体是一个蛋白质的复合物， 这个复合物的结构应该是比较稳定的，而且往往在不同物种这种复合物也是比较表较保守 的， 这样它的生存余地就大多了。 一个成功的病毒， 应该是一个不杀死宿主细胞而又能够在 不同物种间传播的。 像禽流感H 5 N l 能从鸡传染到人， 就应该是识别结构相当保守的复合物。 我们可以大胆地推测， 凡种特异性不强的病毒的受体一定是结构很保守的蛋白质复合物。 最 近在E B病毒的研究已 经发现除了C D 2 1 蛋白 外， 还要其他蛋白 质作为共受体来感染靶细胞。 二、鉴定受体的方法 随着研究手段的进步， 近年来有关病毒受体的研究己 有较大进展， 部分病毒受体的结构 和功能已在不同程度上得到确认。 绝大多数受体的本质是蛋白， 所以研究蛋白相互作用的方 法都可用来研究受体。 鉴定受体的研究方法总体上从蛋白 和基因两个途径入手。 较早用于研 究蛋白 质2 蛋白 质相互作用的方法是偶联、 免疫共沉淀等生物化学方法及病毒蛋白 铺覆技术 ( V O P B A ) 等。 近年来开始采用一些以D N A重组克隆为 基础的 分子生物学方法， 如噬菌体展 示、 酵母双杂交系统等。 每一种方法各有所长， 有时需要联合应用， 相互印证结果的可靠性。 鉴定受体概括地说应包括以下两方面的内容: 1 确定受体存在是病毒能结合和感染靶细 胞， 缺乏受体时， 病毒则不能结合或感染靶细胞。 2阐明自 然状态下病毒与所鉴定的受体的 相互作用 2 0 . ( 一) 病毒结 合 胞膜蛋白 印 迹 技术( v i r u s o v e r l a y p r o t e in b l o t a s s a y , V O P B A ) V O P B A系将细胞膜溶解物经S D S - P A G E分离， 蛋白带转印至硝酸纤维膜上， 加病毒以 便与受体特异性结合， 通过免疫酶、 同 位素或化学发光等指示系统显示与病毒特异性结合的 蛋白条带， 这种与病毒结合的蛋白 可能就是受体。 但受体分子为一种以 上多肤组成的复合物 时， 此法不适用。 此方法中， 受体活性必须以单个多肤表达， 该多肤能够在没有其他细胞膜 成分帮助下被病毒所结合， 并在去垢剂中不失活。 使用本方法的前提是受体活性是由单一多 肤决定而不需要膜的其它组份， 而且经过裂解液的处理不会丧失活性。 如是碳水化合物型受 体， 就可用薄层层析来分离糖脂， 然后检测与病毒的结 合情况【 2 1 。 用此方法进行受体研究 的 病毒有:登革热病毒 2 2 、 斜纹夜蛾多 角体包埋型病毒【 2 3 、 牛病毒性腹泻病毒、 犬细小 病毒、 犬瘟热病毒 2 4 、 麻疹病毒 2 5 , 2 6 . 狂犬病病毒 2 7 、 伪狂犬病毒、 猪流行性腹泻等。 ( 二) 用噬菌体表面展示技术鉴定表位 噬菌体展示技术就是将已知病毒受体基因或可能含有病毒受体结构域的基因融合到噬 菌体基因上， 表达产物被展示到噬菌体表面， 利用病毒膜蛋白、 衣壳蛋白 或全病毒作为配体 从噬菌体展示文库中筛选出受体结构域。 噬菌体展示的基本原理就是将外源基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中使之与衣壳蛋白 融合表达，随着噬菌体的成熟装配，融合蛋白 展示于噬菌体表面并能保持较好的空间构型。 到目 前为止，利用此方法已陆续建立了噬菌体随机肤库、抗体库、c D N A展示文库等技术， 并广泛用于配体一 受体关系的研究中. 体载体生长快， 稳定性强， 近年来发 展的入 噬菌体、 T 7 噬 菌体【 2 9 等裂解性噬菌 可表达较长序列， 并且其构象更接近于天然情况， 适合用来构建 c D N A展示文库， 董倩等 3 0 利用T 7 c D N A噬菌 体展示方法筛选了乙 型肝炎 病毒前S l 蛋白 的结合蛋白。 由于原核表达系统没有对真核基因内含子的剪接功能， 所以噬菌体展示系统只 能表达原核生物基因、不需要内含子及外显子拼接的 D N A病毒，或是由真核生物或 R N A 病毒等的m R N A反转录的c D N A 2 8 o ( 三)酵母双杂交技术 酵母双杂交 技术 ( Y e as t T w o - H y b r i d , Y 2 H ) 的 原理是基于转录因 子的 两个启动转录的 必需部分一 一 一 D N A结合区域和转录激活区域可以独立存在于两个不痛的多肤分子，当 这两个多肤相互作用时能重新启动转录的活性。酵母双杂技术应用于未知病毒受体的筛选 构结 时，首先建立病毒易感细胞的 。 D N A文库， 将此文库于转录激活区的核普酸序列融合， 建可表达融合“ 猎物” 蛋白的质粒载体，将推测的受体结合蛋白的基因于转录因子的D N A 合区的核酸序列融合， 构建成可表达的 “ 猎物” 蛋白 相互作用就可以 重建该转录因子的转录激 活活性， 从而启动报告基因的转录与翻译， 生成的产物可以作为筛选标记。 若筛选到阳性克 文献综述 隆， 就获得了 可能为 该 病毒受体的c D N A序列。 李凌云汇 3 1 等将麻疹病毒血凝素蛋白 作为 诱 饵，B 9 5 a 细胞的c D N A文库作为猎物，获得了新的受体基因。该方法灵敏度高，但容易出 现假阳 性和假阴 性， 其对蛋白 在细胞中的定 位有要求【 1 a ( 四)免疫共沉淀技术 免疫共沉淀技术( c o - im m u n o p r e c i p it a t i o n , C o - I P ) 原理为在 溶液状态下或在细胞中， 蛋 白X如能和蛋白Y相互作用，该复合物可以被其中任一蛋白的抗体结合发生沉淀，其基本 过程如下:将含有蛋白X和蛋白Y的细胞进行裂解 ( 不能破坏其结合状态)或直接将蛋白 X和蛋白Y加在同一溶液体系， 将蛋白X的抗体加入细胞裂解液或溶液中 进行孵育， 然后 加入蛋白A( 或G ) - S e p h a r o s e ( 或A g a r o s e ) 颗粒进行沉淀， 经过 洗涤后进行S D S - P A G E ， 用 蛋白Y的抗体进行We s t e rn印迹分析鉴定，或者将蛋白Y进行同位素标记进行放射自 显影 1 。免疫共沉淀法分离与鉴定病毒在宿主细胞上的受体蛋白 分子是利用祸合有G蛋白的 琼 脂糖珠先与病毒抗体结合， 它们结合的复合体再与病毒结合， 最后利用病毒与病毒受体特异 结合把受体祸合出 来 3 2 1 . ( 五) G S T 亲 和柱层析和G S T p u l l d o w n技术 其基本原理是用重组技术将探针蛋白与G S T ( G l u t a t h i o n e S t r a n s f e r a s e )融合，此融合 蛋白 通过G T H ( G l u t a t h i o n e ) 亲和结合。 这样当与融合蛋白 有相互作用的蛋白 在通过该层析 柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而被分离。 其基本过程为: 将待分析的蛋白 质混合 液通 过G S T 融 合探针 蛋白 与G T H - S e p h a r o s e 制成 的 层 析柱， 然后 用 梯 度 洗脱 分离收 集各 蛋 白 组分