食品级乳酸菌高效表达载体系统的研究进展

中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集 ( 2 0 0 6 年广州) 食品级乳酸菌高效表达载体系统的 研究进展 郝凤奇王春凤 ( 吉 林农 业 大 学 动物 科技学院 吉 林 省长 春市 新 城大 街2 8 8 8 1 3 0 1 1 8 ) 摘要:本文 在乳酸菌 表达载 体构建的以往研究 基础上，本文综述T 食品级乳酸菌高 效表达载体系 统 的研究进展. 关键词:食品级乳酸菌表达载体 R e s e a r c h A d v a n c e m e n t i n F o o d - g r a d e H i g h - l e v e l E x p r e s s i o n S y s t e m o f L a c t i c A c i d B a c t e r i a F e n g Q i H a o C h u n F e n g Wa n g C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e M 家 自 然 科 学 基 金( N o .3 0 2 0 0 1 9 9 . N o .3 0 6 7 1 5 7 3 ) ; 吉 林省 杰出 青 年 基金( N o .2 0 0 3 0 1 1 8 ) ; 中 国博 士 后科 学 墓金 项目 ( N o .2 0 0 2 0 3 1 1 5 6 ) ; 吉 林 农 业大 学青年 教 师启动基 金( N o .2 0 0 2 - Q Q N - 0 0 2 ) . 作者: 郝凤奇; ( 1 9 8 1 - ) ， 男. 吉林农业大学预防兽医学科， 在读硕士研究生 通讯作者: 王春风; ( 1 9 7 2 - ) ，女，吉 林公主岭人，教授. 主要从事动物微生物学与免疫学研究 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集 ( 2 0 0 6 年广州) 1 食品级乳酸菌组成型表达系 统 真细菌多 数基因的 共有序列是一 3 5 区T T G A C A ， 和一 1 0 区T A T A A T ， 其间 相距1 7 1 1 b p ， 大 肠杆菌 ( E s c h e r i c h i a c o k e 由了 “ 识 别 ， 枯 草 芽 抱 杆 菌 ( B a c i l l u s s u b t i l is ) 由子 ， 识 别 ， 由 于 乳 酸 菌 组 成 型 表 达 系 统 的启动子是组成型的，能够不停地持续表达出目的蛋白，所以一些学者对乳酸菌的转译过程作了大 量的 研究， 特别是乳球菌属( L a c t o c o c c u s ) 和乳杆菌属( L a c t o b a c i l l u s ) 。 然而， 只有 L a c t o c o c c u s la c t is 携带了 编码主要a 因 子的r p o D基因。 该r p o D基因 可以 编码一个大 小为3 9 k D的 蛋白 质， 该 种蛋 白 质与 营养型B a c il l u s s u b t i l is 6 a 3 和E . c o l i 了 “ 的C 末端具有高 度的同 源性。 目 前对乳酸菌组成型表达系统比 较成熟的 研究方法有三种。 ( i ) 是基于筛选载体的 研究， 使 质 粒和 转座子 携带一些非启动子的 报告基因， 例如: 氯霉素抗性基因 ( c a t - 8 6 ) ， 或p 一 半乳 糖昔酶 基因 ( l a c Z ) ， 或p 一 葡萄糖昔酶基因 烤 u s A ) ; ( i i ) 在不同 细菌的管家基因中 应 用P C R 扩增、 D N A探针等手 段筛选并 纯化具有强表达性的组成型基因， 用于重组载体的 构建; ( i i i ) 在L a c t o c o c c u s la c t is 中 筛选出 组成型的强启动子，该种方法是目 前有关于此方面研究的热点之一， J e n s e n P R等( 1 9 9 8 ) 研究报道， L a c t o c o c c u s l a c t i s 组成型强启动子在基因表达时能够通过调节而执行组成型表达， 并根据这种启动子 序列重组表达载体，其活性可高达 1 0 0 0 倍以上。 张莉等( 2 0 0 5 ) 组建了 柔嫩艾美尔 球虫的T 4 抗原。 D N A ， 并 将此目 的片段亚克隆到L a c t o c o c c u s l a c t is 表达载体p M G 3 6 n 中， 电 穿 孔法转化L a c t o c o c c u s la c t is L M 0 2 3 0 ， 获得重组质粒 p M G 3 6 n - T A 4 , 经酶切、 序列测定后获得了T A 4 I L a c t o c o c c u s l a c t is 表达株， 经S D S - P A G E电泳分析， 结果表明表达 产物与预期大小的T A 4 蛋白分子量一致。 2食品 级乳酸菌 诱导型表达系 统 如上所述，诱导型表达系统的启动子上要携带某些选择标记。然而，食品 级乳酸菌诱导型表达 载体的基本要求是载体中不许含有非食品级的功能性D N A片断。 随着对乳酸菌表达载体深入系统的 研究， 经大量的安全性试验检测，己 经成功的获得了安全性食品级标记基因， 将这些标记基因整合 到 乳 酸 菌的 质 粒中 ， 就 构 建了 食 品 级 表 达 载 体 系 统 。 这 些 表 达 载 体 系 统 主要 有p H 值 诱 导 表 达 系 统， 糖类诱导表达系统， 温度诱导表达系统， N i s i n诱导表达系统和营养缺陷型表达系统。 其中对糖类诱 导表达系统，营养缺陷型表达系统和 N i s i n诱导表达系统的研究相对透彻，综合考虑可食性和高效 性的问题， 此三种表达载体更适合作为食品级高效乳酸菌表达载体系统。 2 . 1 p H 值选 择标 记的 诱导 型 表达系 统 鉴于能 够发酵产酸是乳酸菌的生理 特性之一， 在对表达系统进行 筛选时发 现了p H值依赖型 启 动子， 这种启动子同样也与其他选择压力因子有关。 应用氯 化物， 谷 氨酸或其他酸性物质诱导后g a d 启动 子 能 够启 动 表达， 其具体的 机制尚 不 清楚， 但推 测 可能 是由 于S ad启动子 编码的G a d R蛋白 可 作为转 译激活 物启动基因的表达。 据此， S a n d e r s J W等( 1 9 9 7 ) 在乳酸 菌培养基中 加入0 .5 M的N a C l 可诱导菌体的表达，且表达量多达1 0 0 0 倍。 2 . 2温度选择标记的诱导型表达系 统 对L a c t o c o c c u s l a c t i s 温和型噬菌体。 r l t 的D N A全基因序列进行分析，发现了一个与溶源性有 关的调控区。该调控区由逆转录的2 个启动子组成 ( P 1 和 P 2 ) ，分别控制 r r o 基因 ( 编码阻遏物) 和t e c 基因 ( 编码C r o 的拓扑异构体)的表达。 N a u t a 等 ( 1 9 9 6 ) 研究发现，P 2 启动子的表达受r r o 的阻 遏。 通过获得一个热不稳定的r r o的阻遏物变异体， 从而实现该 系统的 热诱导表 达】 。 N a u t a 等 ( 1 9 9 7 )发现， 培养基温度从2 4 提高到4 2 时，使P 2 控制的表达量提高了5 0 0 倍。 2 . 3糖类选择标记的诱导型表达系 统 2 . 3 . 1乳糖选择标记的诱导型表达载体系 统 所有的乳酸菌都能够利用乳糖，乳糖操纵子是研究最为清楚地乳酸菌操纵子，已 从分子水平上 阐明了 乳糖利用的 控制机制。 乳 酸菌中 乳糖的 运输存在两种不同的方 式， 即磷酸烯醇式丙酮酸( P E P ) 依赖性磷酸转移酶系统 ( P T S ) 和乳糖透性酶系统。编码乳糖透性酶系统的一些类基因组成了 乳酸 菌利用乳糖的操纵子， 并从L e u c o n o s t o c l a c t i s中发现了编码该菌的基因有2 个发生重叠的基因( l a c L , l a c M) ， 二者在该菌 利用乳糖时缺一不可。 中国畜牧兽医学 会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集( 2 0 0 6 年广州) M a c C o r m i c k 等 ( 1 9 9 5 )将完整乳糖操纵子整合到一株敲除质粒的L a c t o c o c c u s l a c t i s MG 5 2 7 6 的染色体上， 并通过双交换使l a c F基因失活， 结果该菌株不能利用乳糖( l a c - ) 。 然后再将克隆有l a c F 基因的质粒转到上述菌株中， 该菌恢复了利用乳糖的能力( l a c + ) , P l a tt e u w等 ( 1 9 9 6 ) 也同样用l a c F 基因 作为 选择标记， 将来 源于E . c o l i 的P - 葡糖醛 酸酶基因( g u s A ) 克隆 到L a c t o c o c c u s la c t is 乳糖操 纵子l a c A启动子的下游， 转到缺失受体菌中， 转化后该菌能够利用乳糖。 T a k a l a等 ( 2 0 0 3 ) 将干酪 乳杆菌( L a c t o b a c i l l u s c a s e i) 的 磷酸 化R 一 牛乳 糖酶基因 人工缺失1 4 1 b y ， 构建了 该菌株乳糖利用缺陷 型，并用L a c t o b a c i l l u s c a s e i 的l a c G基因和鼠 李糖乳杆菌的l a c G启动子基因构建了能够启动乳糖发 酵的 质粒p L E B 6 0 0 ， 将该 质粒转 化入上述人 工缺陷 型菌株后， 该菌株即 可利用乳糖。 最近十年来的 研究，已经成功的应用乳糖作为选择标记构建出食品级表达载体系统。 2 .3 .2 D 一 木 糖选择标记的 诱导 型表达载 体系 统 乳杆菌中只有少数菌株可以 利用D 一 木糖为碳源， 而且与木糖发酵有关的基因也研究的较为清楚。 P o s o n 等把发酵木糖的戊 糖乳 杆菌M D 3 5 3 染 色体上的州 基因 簇克隆到E . c o l i 和L a c t o b a c i l l u s 穿梭 载体p L P 3 5 3 7 ， 得到重组质粒p L P 3 5 3 7 x y l , 再 将其转入到不能利用木糖的L a c t o b a c i l l u s c a s e i A C T T 3 9 3 和 植物乳杆菌( L a c t o b a c i l l u s p la n ta r u m ) N C D O 1 1 9 3 中， 结果转 化子能 够在含有仅含有木糖的 培养基 上生长，这样就构建了以D 一 木糖为选择标记的表达载体。 2 .3 .3蔗糖选择标 记的 诱导型 表达系 统 L e e n h o u t s 等( 1 9 9 8 ) 以 几 种乳 酸菌中的基因片断为基础构建了 蔗糖诱导型食品级表达载体系统。 该 系 统的 组 分包 括: 乳 酸菌中 的 戊 糖片 球 菌( P e d i o c o c c u s p e n t o s a c e u s ) P P E 1 .0 中 的s c r A ls c r B 基因( 能 够 编 码 转 运 蔗 糖 和 水 解6 - 磷 酸 蔗 糖 产 物) ， 乳 球 菌 质 粒P W V 0 1 的 复 制 起点( o r i + ) ， 一 段多 克 隆 位点 和 一段乳球菌染色体上研究非常 清楚的D N A片断。 此外， 还需 要L a c t o c o c c u s la c t is L L 1 0 8 或L L 1 0 2 , 二 者 可以 产生为o r i +型 质 粒 复 制时 所 必需 的P W V 0 1 的R e p A 蛋白 。 2 .4营养 缺陷 型选 择标记的 表达 载体系 统 D ic k le y 等( 1 9 9 5 ) 在t R N A抑 制 基 因 的 基 础 上 构 建了 一 个 乳 酸 菌 食 品 表 达 载 体p F G I ， 该 载 体 由 乳 酸乳 球 菌一 个 质粒的 最 小复 制子、 乳 酸菌的 赫 石突 变 ( O c h r e ) 抑制基因: u p B 及一段 人工合成 的含有1 1 个限制酶切位点的多克隆位点组成。 载体大小约2 k b . 当与嚓吟生物合成途径中的基因发 生 储 石 突 变的 宿 主 联 合使 用 时， s u p B 便 可 用 作 选 择 性 标 记。 S o r e n s e n 等( 2 0 0 0 ) 用 玻 拍 突 变( A m b e r ) 抑制 基因s u p D 构 建了 可抑 制I Q 营 养缺陷的 一个 食品 级 载 体p F G 2 0 0 0 P i n t e r 等( 1 9 9 8 ) 从L a c t o b a c i l l u s c a s e i 中 克 隆 了t 句 rA 基 因 ， 并 对 其 进 行 测 序。 以内 rA 基 因 为 选 择 压 力 重 新 构 建 了 质 粒p U C 9 , p U C 1 8 和p K G S ， 以 这 些 衍 生 质 粒为 载 体 使 许多 可 溶 性 蛋白 在 含 有t 句 rA基因 缺陷型的E s c h e r i c h i a c o l i 中 得以 表 达。 R o s s 等 ( 1 9 9 0 ) 从L a c t o c o c c u s la c t is 中 也克隆 了 内 rA 基 因 并以 此 为 选 择 压 力 构 建了 质 粒p P R 1 0 1 和p P R 1 0 2 以 及 导 入内 rA 基因 缺陷 型 的E s c h e r ic h ia c o l i 中 进 行 表 达。 王 春 凤 等( 2 0 0 1 ) 利 用 胸 首 酸 合 成 酶( 向 M ) 基 因 替 代穿 梭 载 体p W 4 2 5 e 中 的 红 霉 素 抗 性 基因 ， 得 到了 以t 句 A为 选 择 压 力 的 非 抗 性 重 组 质 粒 表 达 载 体p W 4 2 5 t ,该 质 粒 转 化内 rA 基因 缺 陷 型的 嗜酸性乳杆菌 ( L a c t o b a c i l l u s a c id o p h i l u s ) D O M L a S 1 0 7后， 转化体可以 在不含胸营酸的 培养基 上 生长 。 并 将 鸡 柔 嫩 艾 美 耳 球 虫S 0 7 基 因 整 合 到 表 达 载 体p W 4 2 5 t 上， 在 乳 酸 菌 中 得到 表达， 表 达 产 物 经S D S - P A G E , W e s t e rn - b l o tt in g , 1 D - M U L T 1 分 析， 表 达蛋白 约 为2 6 k d ， 占 乳 酸 菌 菌 体 总蛋白 的1 4 . 5 %， 通过动物实验证实， 转柔嫩艾美耳球虫S 0 7 基因乳酸菌抗球虫指数 1 6 3 .4 0 一即达到良 好 水平，这一结果与S 0 7 基因的免疫保护功能相符合。 2 .5 N is i n 基因 选择标记的 诱导 型表达系 统 ( N I C E ) 在研究受控于 N i s i n表达系统 ( N I C E )的基础上， 成功的构建了一种高度通用，受控严格的食 品级高效蛋白 表达系统。 乳链菌肤 ( N i s i n ) 是由 某些L a c t o c o c c u s l a c t i s产生的抗生物肤类， 这种肤 类在翻译后经过了分子修饰。目 前， N i s i n已 作为天然的防腐剂应用于食品工业。 N i s i n的产生需要 I I 个基因，其中n is K( 起传感蛋白 作用的组氨酸激酶) 和n i s R( 应答调节物)是双组分调节系统， 并 且 3个启动子中的 n is A和 n is F启动子可被 N i s in诱导。 K u i p e r s 等 ( 1 9 9 5 ) 提出了一个 N is in生物 合成自 身调 节的 模型，首先， n is K识别 N i s in分子 ( 最低浓度为 0 .0 5 n g / m l ) ，然后n is R在n is K的作 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集( 2 0 0 6 年广州) 用下发生磷酸化，磷酸化的n i s R可作为应答调节产物激活n i s A启动子，从而启动下游基因的转译。 这种调节系统属于依赖于肤类信息素的传感系统，广泛的存在于革兰氏阳性细菌中。 D e R u y t e r P G G A ;j ( 1 9 9 6 - 1 9 9 8 ) 研究 结果 表明， n is A启 动 子 在 被 修剪 缩 短至5 0 b y 时， 用 于 构 建转录和翻译的融合载体，并成功地表达了氨基转移酶N ，表达量为菌体蛋白总量的5 0 % 之多。 当带有n i s A启动子及其所控制的外源目的基因的质粒导入不加N i s i n或其类似物而具有n i s R 和n i s K基因的乳酸菌中时， 外源基因的表达很弱， 甚至检测不到。 但当 对数生长 期时在培养基中加 入 N is in ( 0 .0 1 - l 0 n g / m l ) 后 ， 由 n is A启 动 子 控 制的 外 源 基因 的 转 录 被 激 活 ， 其表 达 水 平 在 一 定 范围 内 随 N i s i n加入量成比例上升， 最高诱导效率可达1 0 0 0倍以上。 C h i- M i n g W U 等 ( 2 0 0 5 )以 质粒p S T E 3 2 作为 基础载体， 成功的 构 建了 表达载体系统 一p N I C E ( a m y , S e c - ) ， 该系统包括: L a c t o c o c c u s l a c t is的 2 . 1 k b 大小的 n is R K基因、 3 5 0 b y 大小的 n is A启 动 子( 含有其一 3 5 到 一 1 0 区 域) 、 核糖体结合位点( R B S ) 和B a c i l l u s s u b t i l is 的 r r n B终_(t 子。 然后， 应用 P C R 在ff样芽胞杆菌 ( B a c i l l u s l i c h e n if o r m is ) 基因 组中 扩增一段大小为1 2 0 b y 的 X b a I - S p e I D N A 片段， 将 其克 隆 到p N I C E的X b a l / S p e I 位点， 构 建出 表达 一 分 泌型 载 体 一p N I E S ( a m y + , S e c + ) 。 应用淀 粉 酶 基 因 ( a m y L ) 和a m y L - S P A ( 缺失信号 肤的 a m y L 基因 作为 报告基因，以 N i s in为诱导 物对构建的 两种 载体 进行表 达和分 泌的 检测。 融合 质粒 p N I C E - a m y S P d 和 p N I E S - a m y S P a 转 化到罗 依乳 杆菌 ( L a c t o b a c i l l u s r e u t e r i) ， 经 测 定N is in的 适 合添 加 浓 度范 围 是 。 - 5 0 n g / m l ， 在 此 浓 度范 围 内 ， 报 告 基 因( a m y L - S P A) 的 表达量与 N i s in的添加浓度呈正相关。 采用凝固 蛋白 描记法对菌体细胞内 外目 的 蛋白 表达及分泌进行测定。 结果显示， L a c t o b a c i l l u s r e u t e r l p N I C E - a m y S P A 在最大诱导 剂量下目 的 蛋白 表达量占 菌体胞内 产物总蛋白 量的1 8 % ; L a c t o b a c i ll u s r e u t e r / p N I E S - a m y S P A菌体悬液中目 的 蛋 白 最大剂量诱导后的 产量为2 7 .2 5 m g / L . 3小结 目 前的 研究表明，在乳酸菌中确实存在着一些携带食品级选择标记的启动子。在特定诱导物的 存在下，目的基因能够依赖这些启动子进行表达以 减少表达产物对宿主细菌的不利影响。 上己 述及， 可用 作 食品 级 乳 酸 菌 诱 导 型 表 达 载 体的 选 择 信号 有: p H 值， 温 度， 糖 类， 营 养 物 质 和 乳 链 菌 肤( N i s in ) o 然而， 从“ 食品级表达载体” 的概念上看， 前三者虽可划入此列， 但可行性分析结果表明，能否 将其 推r “ 应用仍值得进一步商榷。 3 . 1 p H 值选 择标 记的 诱导 型 表达系 统 M a d s e n 等( 1 9 9 9 ) 研究 表明 ， 这种 表达系统中 的 启 动子( P 1 7 0 ) 是 受低p H值与 低温正向 调节 的， 尽管 体外试 验使P 1 7 0 的 p H诱导提高 5 0 倍。 但 基于 受 体菌 定 植于 人和 动 物的 肠道内 ， 受 体 菌 是 否能 产生启动表达的 低p H值以 及一旦产生的酸性环境能 否影响 肠道内 正常的 微生态( 尚 未报道) ; 再者， 人和动物肠道内 的 温度是否符合该表达系统对低温的 要求( 尚 未报道) ， 这种 p H值诱导型表 达载体的食品级应用仍有质疑。 3 . 2温度选择标记的 诱导型表达系统 前已 述及， 该种类型表达系统中启动子的最适宜温度是4 2 C。 然而， 人体肠道内的正常温度约 为3 7 . 5 C ,畜禽中 猪、牛、马和鸡肠道内正常的温度分别约为3 9 .2 C . 3 8 . 3 C . 3 7 . 6 和4 1 . 7 *C . 因此热诱导型表达系统与高效型表 达相距甚远。况且， 热诱导作用还可引起热休克基因的表达。 3 . 3糖类选择标记的诱导型表达系 统 乳糖是常见的二糖， 存在于所有研究过的哺乳动物的乳汁中， 乳糖的水溶性很低，因而在肠道 内吸收相对很慢，可被乳酸菌 利用。D 一 木糖在植物细胞壁中多以戊聚糖的形式存在，大量的 存在于 秸秆、玉米及种子和果实的外壳 ( 棉籽壳、花生壳)中， 进入动物体内不经消化酶分解、直接经空 肠粘膜吸收，不在体内 代谢，经肾排出。蔗糖俗称食糖，是最重要的二糖，它形成并I - 泛的存在于 光合植物 ( 根、茎、叶、 花和果实)中，被人和动物食入后可在小 肠内被消化吸收.由于 动物肠道 内正常条件下存在这些糖类，故应用其作为选择标记所构建出高效的乳酸菌表达载体系统有望用于 工业生产。 3 . 4营养 缺陷 型选 择标记的诱导型表达系 统 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集( 2 0 0 6 年广州) 营养缺陷型标记是一类以细菌管家基因缺陷株为受体菌，在质粒上克隆入同源或异源完整的受 体菌 缺陷 基因作为 外源基因 稳定 表达的 选择标记。 D ic k l e y 等 ( 1 9 9 5 ) 和 S o r e n s e n等 ( 2 0 0 0 ) 所构 建的选择标记均属无义突变抑制基因， 这种突变基因较之其他食品级标记有许多优点。 它使用灵活， 可在多种培养基上进行选择;其基因产物是R N A ，而不是蛋白 质，因此不会有酶活性或抑菌作用。 但t R N A抑 制基因 可能会导致多 重效应， 这是 其不利因 素。 而王春凤等 ( 2 0 0 1 ) 采用t h y A为 选择标 记 构建的非 抗性表 达载体转 入内rA 缺陷型乳酸菌中， 能 够有效地 表达出 具有其保护活性的目 的 蛋白 。 构建及表达过程均对动物和环境无不良 影响，符合了 食品级乳酸菌高效表达载体系统的要求。构建 的表达载体系统作为基因工程的高技术操作平台，为各种外源和内源的功能基因通过此载体在肠道 共生乳酸菌中表达，更好地发挥转基因工程乳酸菌的双重功能开创了一条崭新的道路。 3 . 5 N i s i n 选择标记的诱导型表达系统 在L a c t o c o c c u s l a c t i s中发现有一些菌株不产生N i s i n ，但对其存在抗性。利用乳酸菌的这一特性 以 N is in为 选择压力构建了 高 效稳定的 表达载体系统 ( N I C E ) 。该系统具有如下 优点: ( i ) N i s in是 由 乳酸菌产生的一类抗生物肤，作为食品级诱导分子， 具有高效、安全、无毒的特性， 能直接用于食 品中。 ( i i ) 采用诱导型表达替代原来的组成型表达， 使细菌生长 与外源基因的表达分为两阶段， 从 而减轻了宿主细胞在表达目的蛋白时的代谢负荷。( i i i ) 诱导剂的获得相对容易， 产N i s i n菌株稀释 的上清液即 可用作诱导剂， 所以生产N i s i n的菌株可以 包含在发酵液中， 并可简单地加入小量的 N i s i n 来进行诱导， 而其他起始培养细菌不会遭受亚抑制量N i s i n的损害。随着一些N i s i n突变体的构建成 功， 甚至可用比 野生型菌株所需的更 低浓度的 乳链菌 肤作为诱导剂。 ( iv ) 诱导后蛋白的 表达量最高能 达到菌体 胞内蛋白 总量的 6 0 % , 并且表达水平 1 ,0 0 0 个诱导量时， 其诱导水平直接决定于 N i s in添加 的 剂量。 ( v) 受控严格，非诱导条件下不表达基因的 产物或表达剂量很小以至于检测不到。 ，因 此， 比 较而言应用糖类选择标记、 营养缺陷型选择标记和 N i s i n基因选择标记所构建的表达 载体可用于食品级乳酸菌高效表达载体系统的构建， 有望实现工业生产。 乳酸菌除了 可以 作为 食品级高效表达载体的 受体菌株外， 还具有其他菌体无法比 拟的 益生功 能。例如:抗肿瘤、抗突变，抗原性刺激以及改善肠道菌群维持肠道微生态平衡等作用， 在此不做 赘述。 4食品级高 效乳酸菌表达载体系 统的 展望 由于食品级高效乳酸菌表达载体系统具有如下的 优越性: 安全性， 食品级高效乳酸菌表达载体是 绝 对安全的， 可以 直接供人和动物食用。 简便性， 乳酸菌 作为 受体菌株可在人和动物肠道内 长期定 植，并 产生目 的 产物， 一次 服用长期受益， 省去了 常规发酵过程和繁琐的提取工艺。 可控性， 这些 诱导型表达载体均携带有选择标记，目的基因的表达严格地受控于诱导物。因此，无论在体外筛选 还是体内的表达，其他载体系统都无法比拟。 4 . 1表达杭原基因， 研制各种口 服疫苗 目 前，重组细菌的保护性抗原的表达受体主要是活的减毒病原菌，其免疫效果有赖于所用受体 菌株的繁殖能力、 侵袭能 力、 存活时间 及相应抗原基因的 表达水平。 细菌疫苗的免疫保护力 往往和 菌株的残余毒力成正比。 所以 人们试图寻找良 好地表达外源性抗原且安全的受体菌株。 乳酸菌为人 及动物体内正常菌群的重要成员，以乳酸菌作为表达保护性抗原基因的受体，就可以 将乳酸菌的非 特异性抗感染能 力和疫苗抗原的 特异性免疫相结合，同 时乳酸菌作为正 常生理性细菌， 又符合新型 疫苗的口 服安全、 方便、 廉价、不依赖冷链等特点。 这类疫苗的研制成功将为新型疫苗的发展探索 一条新路。 动物机体存在着完整的砧膜免疫系统，该系统包括肠道相关的淋巴组织、呼吸道淋巴组织及乳 腺、泌尿生殖道薪膜。 肠道壁是机体的最大免疫器官， 其勤膜产生的抗体远远大于体液，加之4w膜 又是大多 数病原的 入口。 因而， 有人预测: 未来的疫一苗 将主要发展成为经肠道免疫的疫苗。 “ 植物疫 苗” 就是根据a膜免疫的机理设计的。迄今，国外研究人员试图把乳酸菌作为免疫原基因的受体菌， 口 服以 后 在体内 产生 抗体， 这方面的 工作已 经 起步。 比 如 变 形 链球菌 ( S tr e p t o c o c c u s m u t a n s ) 是 人所 共 有的引 起龋齿的 致病菌， M as o a k i 等人把细胞表面抗原结构基因 通过穿梭载体p S A 3 ， 转到乳链球 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集 ( 2 0 0 6 年广州) 菌( S tr e p t o c o c c u s l a c t is ) 中，制成活菌制剂， 饲喂给小鼠， 发现唾液中I g A和血液中免疫球蛋白 对 S tr e p t o c o c c u s la c t is 和表面蛋白 抗原有很强的反 应。 由于乳酸菌可以在人和动物体内定植、繁衍、生殖， 这种疫苗可能具有“ 终身保护性” 或“ 长期保 护性” ，达到一次免疫、长期保护的目的。 4 . 2表达抗体基因，治疗各种感染 如果将产生特异抗体的基因表