L05080蔡毅－结题论文

多糖的电泳技术研究 刘贯明 林先丰 蔡毅 黄翠颜 陈伟贞（华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642）摘 要：本项目的研究目的就是通过改善不同性质多糖的琼脂糖凝胶和聚丙烯烯胺凝胶的电泳条件，探讨不同的染色剂和脱色剂对多糖电泳分辨率的影响因素，改变传统的电泳染色方法，进一步提高中性多糖和酸性多糖的分辨率,希望能为电泳技术用于多糖分析检测方面提供有价值参考依据;同时推动生化综合性、创新性实验课教学和科研项目的研究。关 键 词：多糖；聚丙烯酰胺凝胶电泳；琼脂糖凝胶电泳；染色剂中图分类号： 文献标识码：聚丙烯酰胺凝胶电泳法为现今蛋白质化学研究中必不可少的重要方法，其使用范围极为广泛，已成为生物化学研究工作者必需掌握的实验手段。但多糖的电泳分离技术研究起步较缓慢，然而随着生命科学的研究迅速发展，多糖具有可与核酸或蛋白质比拟的信息功能的研究不断拓展，迫切需要通过较常规的电泳技术检测多糖的纯度、种类、分子量等性质。所以凝胶电泳技术在多糖分离制备和鉴定方面的应用近年来日益受到重视，随着新的电泳缓冲液引入和不同的试剂的实验探讨研究大大地提高了电泳对各种多糖的分辨能力，并扩大了它的应用范围。聚丙烯酰胺凝胶电泳特有的分子筛功能使本法成为广为应用的生物大分子鉴别和分子量测定工具1-7。和蛋白质不同，多糖的不均一性使其电泳分离技术的难度加大，多糖电泳后的染色和脱色也较复杂，不同性质的多糖需要不同的染色液，从而导致多糖电泳的分辨率较低。同时通过查阅国内国外对此方面的研究论文和资料得知：在提高多糖电泳的灵敏度和分辨率的研究很少。本项目的研究目的就是通过对多糖进行琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，探讨中性多糖、酸性多糖的电泳现象，对不同的染色剂的染色和脱色进行摸索，改变传统的电泳染色方法。使染色脱色时间尽量缩短，同时保持相对较高的灵敏度（即分辨率），此外由电泳后染色带的宽度可提供样品分子量分散度的信息。1 材料与方法1.1 材料试剂与仪器设备1.1.1 材料试剂菇多糖（本室自提）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵、浓HCl、Tris、硼砂、氢氧化钠、蔗糖、碱性品红、偏重亚硫酸钠、活性炭、TCA、高碘酸、冰醋酸、TEMED、甲醇、甲醛、溴酚蓝、肝素钠（肝素，上海伯奥生物技术公司）。1.1.2 仪器北京市六一仪器厂DYC-23A型电泳槽；江苏海门市麒麟医用仪器厂TS-1型脱色摇床；湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司电热恒温鼓风干燥箱；中国上海科析试验仪器厂恒温培养箱KXB-14A；eppendorf 5810R高速离心机；HWS24型电热恒温水浴锅；磁力搅拌器；Vivascience超虑器；抽滤装置；低温冰箱。1.2 方法1.2.1多糖的聚丙烯酰凝胶电泳研究 1 ,4采用不连续PAGE垂直电泳，浓缩胶浓度为5，分离胶浓度为127。电泳时浓缩恒电流40mA，分离胶胶恒电流80 mA。1.2.1.1 schiff染色中高碘酸的氧化作用8染色方案一：（1）10TCA固定30min，摇床振荡,用蒸馏水洗胶23次。（2）Schiff试剂染色10min,避光，用蒸馏水洗胶23次。（3）1高碘酸氧化3040min，摇床振荡中用蒸馏水洗胶46次。（4）0.5新配的偏重亚硫酸钠洗胶5min。（5）于7醋酸溶液中保存。染色方案二：（1）固定同上。（2）用1%高碘酸进行氧化，4050min，倒去高碘酸溶液，用蒸馏水洗去高碘酸，摇床中，每5min换一次，更换数次。（3）加shiff试剂，室温避光染色4050min。（4），（5）同上。1.2.1.2 schiff染色后不同漂洗时间比较schiff染色按上述方案二进行，但第一块胶高碘酸处理后，蒸馏水漂洗时间缩短至15min；第二块胶高碘酸处理后，蒸馏水漂洗时间延长，蒸馏水洗第一次7min,第二次7min,第三次8min。1.2.1.3 schiff染色时间不同比较schiff染色过程按上述方案二进行，但schiff染色处理过程时间缩短：TCA固定由原来的30min 缩短至15min，高碘酸氧化由原来的30min 缩短至15min，观察电泳的染色效果是否有影响。1.2.1.4 多糖schiff染色保存的稳定性比较电泳中常规保存凝胶的溶液是7乙酸，可以不更换保存液而作长时间保存。本实验中比较7乙酸与蒸馏水保存凝胶，试观察其效果。1.2.1.5 甲苯胺蓝染色90.2甲苯胺蓝代替schiff染色液，染色1h，不用脱色，dH2O脱色保存。1.2.2 多糖的琼脂糖凝胶电泳研究5,10-131%琼脂糖水平平板（100mm80mm5mm）：0.25g琼脂糖25ml硼砂NaOH buffer(pH9.4)，电极缓冲液：硼砂NaOH buffer（pH9.4）；恒电流电泳：4080 mA。电泳结束后，割胶进行不同条件的处理。1.2.2.1 多糖的甲苯胺蓝染色剂的研究14-15固定：01CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）；染色剂：0.1%甲苯胺蓝（dH2O配）1.2.2.1.1 不同染色时间的比较选取四个不同的染色时间：16h、12h、2h、1.5h方案一：（1）1CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）固定30min；（2）蒸馏水漂洗；（3）0.1%甲苯胺蓝染色16h；（4）蒸馏水漂洗；（5）混合脱色液（乙酸：乙醇：水0.1：5：5）脱色16h。方案二：（1）、（2）同方案一；（3）0.1%甲苯胺蓝染色12h；(4)（5）同方案一。方案三：（1）、（2）同方案一；（3）0.1%甲苯胺蓝染色2h；(4)（5）同方案一。方案四：（1）、（2）同方案一；（3）0.1%甲苯胺蓝染色1.5h；(4)（5）同方案一。1.2.2.1.2 不同脱色剂的比较采用两种脱色剂：7乙酸、混合脱色液（乙酸：乙醇：水0.1：5：5）方案一：（1）1CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）固定30min；（2）蒸馏水漂洗；（3）0.1%甲苯胺蓝染色2h；（4）蒸馏水漂洗；（5）7乙酸脱色16h。方案二：（1）（4）同方案一；（5）混合脱色液（乙酸：乙醇：水0.1：5：5）脱色16h。1.2.2.1.3 不同脱色时间的比较多糖的琼脂糖凝胶电泳后经过以下步奏处理：（1）1CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）固定30min；（2）蒸馏水漂洗；（3）0.1%甲苯胺蓝染色2h；（4）蒸馏水漂洗；（5）7乙酸脱色16h后：方案一：7乙酸继续脱色4h；方案二：清水浸泡脱色16h；方案三：清水浸泡脱色20h；方案四：清水浸泡脱色24h。1.2.2.2 多糖的阿利新蓝染色16-18固定：12.5%的TCA 染色：0.5%阿利新蓝（3乙酸配）1.2.2.2 阿利新蓝染色剂的研究1.2.2.2.1 阿利新蓝染色中的氧化还原作用方案一：不经过氧化还原作用（1）12.5%的TCA固定30min；（2）蒸馏水漂洗；（3）0.5阿利新蓝染色4h。方案二：经过氧化还原作用（1）12.5%的TCA固定30min；（2）蒸馏水漂洗；（3）1过碘酸氧化50min ；（4）蒸馏水漂洗；（5）0.5偏重亚硫酸钠还原50min ；（6）蒸馏水漂洗；（7）0.5阿利新蓝染色4h。方案三：经高碘酸氧化而不做还原处理除去方案二中的第（5）步处理，即不经过偏重亚硫酸钠还原，其余步奏同方案二。1.2.2.2.2 不同染色时间的比较染色采用1.2.2.2.1中的方案一，即阿利新蓝染色不经过氧化还原处理：方案一：0.5阿利新蓝染色16h；方案二：0.5阿利新蓝染色4h；方案三：0.5%阿利新蓝染色3h。2 结果与分析2.1 多糖的聚丙烯酰凝胶电泳研究2.1.1 schiff染色不同条件比较实验结果表明：方案一见图1，染色时间较短，但凝胶本底基本都染色上红色，影响样品的染色效果，对含量少染色较浅的材料成分不易辨认。而方案二见图2，虽然染色时间较长，但是很好的克服了方案一的缺点，在多糖的电泳图谱分析方面有助于得到准确结果，故在以后的实验染色采用此方法。1 2 1 2 图1 多糖PAGE 图2 多糖PAGE1、菇多糖, 2、鸡血清 2.1.2 schiff染色后不同漂洗时间比较 图3 菇粗多糖PAGE 图4 菇粗多糖PAGE实验结果表明：高碘酸处理后，蒸馏水漂洗时间长，凝胶的本底浅，其染色效果良好（图4）。而蒸馏水漂洗时间短，凝胶的本底很深，染色效果不但不行，整块胶都被糟蹋（图3）。由于水洗时间不足，加入schiff染液进行染色时，染液会立即变红，继而本底在染色过程中被染红；而经TCA处理后用水过洗凝胶3遍，立即进行schiff染液染色，染色过程中，本底不变色，故推断凝胶之所以被污染，是高碘酸残留于schiff试剂所致的原因。2.2.3 schiff染色时间不同比较菇的粗多糖经PAGE后，进行schiff染色，TCA固定由原来的30min 缩短至15min，高碘酸氧化由原来的30min 缩短至15min，从图5可知，电泳的染色效果没有影响。4321 图5 1 对照组，TCA30min，高碘酸30min；2 TCA15min，高碘酸30min；3 TCA30min，高碘酸15min； 4 TCA15min，高碘酸15min；1.2.1.4 多糖schiff染色保存的稳定性比较用7乙酸保存的凝胶（图6），随时间的延长，凝胶本底会逐渐染上红色；而用蒸馏水保存的凝胶（图7），凝胶本底不上色，且电泳带的颜色稳定。但蒸馏水保存凝胶时，在常温下凝胶易发霉，一般15日左右便需要换水。 图6 7乙酸保存的凝胶（常温2个月） 图7 蒸馏水保存的凝胶（常温2个月）1.2.1.5 甲苯胺蓝染色目前甲苯胺蓝染色只对肝素钠有效，而且灵敏度非常高（图8），而其他糖类染色不明显，如何提高染色效果尚有待进一步探讨。1 2 3 4 5 6 图8 1、肝素钠；2、多糖a；3、多糖b；4、多糖c；5、多糖d；6、多糖e；2.2 多糖的琼脂糖凝胶电泳研究2.2.1 多糖的甲苯胺蓝染色2.2.1.1 不同染色时间的比较方案一见图9：甲苯胺蓝染色16h；方案二见图10：甲苯胺蓝染色12h；方案三见图11：甲苯胺蓝染色4h；方案四见图12：甲苯胺蓝染色2h实验结果表明：多糖的琼脂糖凝胶经0.1甲苯胺蓝染色16h、12h、4h，背景颜色均有较深的着色且不易脱去；而在染色2h的情况下背景着色浅，较为均一，并且样品2的斑点集中，轮廓较为清晰；但样品1在4h和2h的染色时间条件下着色很浅，不易辨认，说明在较短的染色时间条件下，样品需要有较高的浓度或者较大的点样量。图9 图10 图11 图12染色16h 染色12h 染色4h 染色2h2.2.1.2 不同脱色剂的比较方案一见图13：混合脱色液（乙酸：乙醇：水0.1：5：5）脱色16h；方案二见图14：7乙酸脱色16h。实验结果表明：混合脱色液（乙酸：乙醇：水0.1：5：5）和7乙酸在甲苯胺蓝的脱色中均有较好的效果，能使背景颜色脱成浅蓝色，样品染色深，斑点其中，在浅色的背景中易于辨认。但多糖的琼脂糖凝胶染色后经混合脱色液脱色，之后浸泡在清水中，样品的染色斑点可保存完好（见图15：经混合脱色液脱色后清水浸泡10天后，样品斑点色深，轮廓清晰，胶体透明，图片中的蓝绿色背景为相机调光所致）；而经7乙酸脱色后浸泡于情水中，样品染色斑点已有部分脱去（见图16，经7乙酸脱色后清水浸泡10天后，胶体透明，图片中的蓝绿色背景为相机调光所致，但样品斑点已有部分脱去）。 图13 图14 图15 图162.2.1.3不同脱色时间的比较图17：7乙酸脱色16h ；方案一见图18：7乙酸脱色16h后，7乙酸继续脱色4h；方案二见图19：7乙酸脱色16h后，清水浸泡脱色16h；方案三见图20：7乙酸脱色16h后，清水浸泡脱色20h；方案四见图21：7乙酸脱色16h后，清水浸泡脱色24h。实验结果表明：甲苯胺蓝染色经7乙酸脱色16h后，背景颜色还未能完全脱去，若继续用7乙酸脱色，样品的颜色易随着背景的颜色一起脱去；而在乙酸脱色后该用清水浸泡脱色20h则可得到的较好的脱色效果（图19、图21中的胶体背景基本为无色，图片中的蓝绿色背景为相机调光所致）。图17 图18 图19 图20 图212.2.2 多糖的阿利新蓝染色2.2.2.1 阿利新蓝染色中的氧化还原作用方案一见图22：未经过氧化还原作用；方案二见图23：经过氧化还原作用；方案三见图24：经高碘酸氧化而不做还原处理实验结果表明：在阿利新蓝染色过程中，经过高碘酸的氧化与偏重亚硫酸钠的还原和直接染色而未经氧化还原作用，其染色效果并无较大的区别（图22中的胶体背景应为浅蓝色，图片中的蓝绿色背景为相机调光所致）；不过从多次的染色经验看，若未经过氧化还原作用，阿利新蓝染色不稳定，有时无法使样品染色，而经过氧化还原作用后一般都能使样品染色，但由于氧化还原经过多次操作，使得琼脂糖胶体较易破碎。从方案三还可看出，若氧化还原不完全则不能使样品染色。图22 图23 图24 2.2.2.2 不同染色时间的比较方案一见图25：0.5阿利新蓝染色16h；方案二见图26：0.5阿利新蓝染色4h；方案三见图27：0.5%阿利新蓝染色3h。实验结果表明：阿利新蓝染色4h便能使得样品着色，样品斑点清晰，与染色16h相比，其背景颜色均一（图26、图27中的胶体背景应为浅蓝色，图片中的蓝绿色背景为相机调光所致），当染色时间少于4h时，样品无法着色，因而推断在多糖的琼脂糖凝胶电泳中，0.5%阿利新蓝最佳的染色时间为4h。图25 图26 图27 3 讨论3.1 多糖的聚丙烯酰凝胶电泳研究多糖的聚丙烯酰胺电泳是检测物质含多糖成分的一种快速、有效的手段。整个实验对糖电泳的条件以及染色作了一些探讨。实验材料主要为酸性多糖，电泳所用的电极缓冲液为pH9.4的硼砂氢氧化钠电极缓冲液，电泳时间约为两个小时左右。该缓冲液在此pH下能得到较理想的电泳条件和电泳效果。电泳时离子强度不宜太高，故pH值不能太高；pH值过低电泳时间太长，给实验带来不必要的麻烦。多糖电泳采用不连续胶电泳。为了方便操作，浓缩胶采用5的浓度。分离胶采用7.5的浓度，该浓度的分离胶能使各种多糖组分较清晰地区分开来，从而获得比较准确的电泳图谱。实验曾尝试过各种浓度的分离胶，发现一般情况下，浓度偏低的分离胶组分聚集不理想，扩散比较厉害，图谱不清晰；而浓度偏高的分离胶，组分之间泳动距离太短，无法区分开来，因而较理想的胶浓度为7.5。电泳的电场为，浓缩胶恒流1620mA，分离胶恒流3240mA。对于多糖的染色，实验尝试了三种染色剂，分别为schiff染色剂，甲苯胺蓝和阿利新蓝。后两种染色剂染色效果不明显，如何提高染色效果，适用到各种酸性糖的染色，尚待进一步的探讨。实验过程中主要采用schiff染色获得电泳结果。该染色方法对凝胶糖组分有很好的染色作用，能得到比较满意的结果。基于schiff染色方法中高碘酸所起的关键作用，实验中对该染色方法作了一些改进，缩短了整个染色过程所耗费的时间，稳定了染色效果。3.2 多糖的琼脂糖凝胶电泳研究3.2.1琼脂糖凝胶浓度：水平平板电泳的最适浓度为1琼脂糖凝胶，此浓度的琼脂糖凝胶具有一定的韧性，且胶体孔径为85nm，适合多糖的电泳分离；0.5的琼脂糖凝胶过于柔软易碎，实验操作困难，且样品染色后出现弥散，斑点不清新；1.5的琼脂糖凝胶则较适合用于垂直平板电泳。3.2.2电泳电流：恒流3280mA为较适的电流强度，电流过高或者过低都会造成样品的脱尾。3.2.3染色：3.2.3.1甲苯胺蓝染色最佳方案：（1）1CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）固定30min；（2）蒸馏水漂洗；（3）0.1%甲苯胺蓝（蒸馏水做溶剂）染色1.5h；（4）蒸馏水漂洗；（5）7乙酸脱色16h；（6）清水浸泡脱色24h。该方案能使样品着色斑点集中，轮廓清新，背景颜色可基本脱去，得到较为透明的胶体背景。3.2.3.2阿利新蓝染色最佳方案：（1）12.5%的TCA固定30min；（2）蒸馏水漂洗；（3）0.5阿利新蓝（3乙酸配）染色4h。该方案与甲苯胺蓝染色比较，其优点是能使得部分水提粗多糖染色出带；但是凝胶的背景颜色深，不易脱去，且该染料价格昂贵，不适合重复实验的探索。参考文献：1张维杰.复合多糖生化研究技术（第二版）M.杭州:浙江大学出版社,1999,75-91.2刘颖华,何开泽,张军峰等.川牛膝多糖的分离、纯化及单糖组成J.应用与环境生物学报,2003,9(2):141145.3 齐春会,黄琳娟,张永祥等.枸杞糖缀合物及糖链的化学结构与免疫活性J.中国药理学与毒理学杂志,2001,15(3):185-190.4 吕志华,赵峡,于广利等.硫酸多糖电泳方法的研究J.中国生化药物杂志,2002,23(1):17-18.5郑震寰,尹鸿萍,张芳等.螺旋藻多糖的琼脂糖凝胶电泳鉴别J.中国生化药物杂志,2003,24(1):34. 6Edens R E ,Al Haklim A,Weile J M,et al.Gradient