邓国祥论文（06-04-02）

华南农业大学大学生科技创新活动项目 片形吸虫内转录间隔区（ITS）序列的多态性研究邓国祥、陈蓓蓉、李秋燕、林瑞庆、朱兴全（华南农业大学兽医学院 广州 510642）华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心摘 要片形吸虫属片形科片形属，主要寄生于牛、羊等反刍兽，也可寄生于人类的肝胆管，引起慢性或急性肝炎和胆管炎等病变，并伴发全身中毒和营养障碍等症状。片形吸虫主要有两个种：肝片形吸虫(Fasciola hepatica)和大片形吸虫（Fasciola gigantica）,研究表明，两个种虽然形态相似，但在抗原性、免疫原性、致病性、对药物的敏感性等方面均存在差异，因此正确鉴别其种类，对该病的控制具有重要意义。由于传统的形态学鉴别有一定的局限性，近年来国内外一些研究者通过染色体分析、生物化学分析和分子遗传学分析等来对片形吸虫进行分类并取得一定成绩。本研究在这些研究的基础上，将来自我国不同地区的片形吸虫进行总DNA的提取，用PCR的方法扩增rDNA的内间隔转录区1（ITS-1），PCR产物在非变性聚丙烯酰胺胶中进行Cold-SSCP电泳，电泳后用溴化乙锭（E.B）染色，成像系统观察并分析带型，不同地区样品经Cold-SSCP分析，显示出两种带型，广西样品和贵州样品属于一种带形，南京和甘肃样品属于另一种带型。样品测序及序列分析证明分别为大片形吸虫和肝片形吸虫。本研究首次建立了Cold-SSCP方法对片形吸虫进行分子鉴定，其结果将为片形吸虫病的进一步分子生物学研究和防治奠定基础。关键词：片形吸虫；第一内转录间隔区(ITS-1)；Cold-SSCP；序列分析目 录1 前言42 材料与方法52.1 材料52.1.1片形吸虫样品52.1.2 主要试剂52.1.3溶液52.1.4 主要仪器62.2 方法62.2.1虫体处理 62.2.2虫体的消化 62.2.3虫体DNA的抽提62.2.4 ITS-1部分序列的PCR扩增72.2.5 Cold-SSCP分析92.2.6样品ITS-1全序列的扩增及测序103 结果与分析 103.1 ITS-1部分序列的PCR扩增103.2 Cold-SSCP分析113.3 ITS-1全序列的PCR扩增113.4 测序结果和分析124 讨论12致谢14参考文献151 前言片形吸虫属片形科片形属(Fasciola)，寄生于肝脏胆管内，引起慢性或急性肝炎和胆管炎、实质性肝炎和肝硬化等病变，是一种危害牛羊等反刍兽和人类的寄生性蠕虫，呈世界范围分布1。在我国，片形吸虫常见的2个种是肝片形吸虫和大片形吸虫。这2种吸虫形态极其相似，但在虫体抗原性、免疫原性、致病性、药物敏感性等方面均存在差异2。因此，正确鉴别其种类，对片形吸虫病的防治与控制具有重要的意义。长期以来，片形吸虫的分类鉴定主要依据成虫的形态、生活史、流行病学等特征来进行，这在分类学的发展上曾经起了重要的作用。但由于片形吸虫种内个体差异较大，同一虫种又因宿主种类、宿主反应的不同而异，导致虫体的形态不规则。鉴于传统的形态学鉴别有一定的局限性，近年来，随着细胞学、分子生物学、分子遗传学的发展，学者们已经开始从细胞水平、分子水平探讨片形吸虫的遗传变异分类。其中，单链构象多态性分析(SSCP)是Orita3于1989年建立的一种简便、灵敏的基因突变检测方法，随后，Hayashi等4将SSCP与聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）相结合，用SSCP来分析PCR扩增的DNA片段，因而被命名为PCR-SSCP。此法的基本原理是：PCR产物经热变性或化学变性后形成单链，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，单链DNA分子的电泳迁移率不仅与DNA片段的长度有关，而且还与单链DNA所形成的空间构象有关。 PCR-SSCP技术在寄生虫学领域已得到日益广泛和深入的应用，尤其是近几年来用于寄生虫的分子分类学、分子遗传学、虫种及虫株鉴定等方面的研究已取得了很大的成功，但由于同位素的使用所以存在一定的安全性问题，近年来有些研究应用改良的不使用同位素的Cold-SSCP方法并取得成功5-6。本项目以Cold-SSCP方法，研究了我国不同地区片形吸虫第一内转录间隔区(ITS-1)序列在片形吸虫种间、种内的变异情况，避免了同位素的使用和X光片显影、定影等的繁复步骤，保持了PCR-SSCP的敏感性，又不存在生物安全性问题，为片形吸虫的分子鉴别提供一种敏感、可靠、简便的方法，为片形吸虫病的鉴别诊断、分子流行病学调查以及防治等更为深入的研究奠定基础。2 材料与方法2.1材料2.1.1片形吸虫样品虫体的采集地分别是广西、贵州、南京、甘肃等地（表1）。表1 本项研究所用片形吸虫样品样品来源地 代码 数目 宿主 感染方式 保存方式 广西 FgGXB1、FgGXB7 2水牛 自然感染 冻干保存 贵州 FgGZG1 1 山羊 自然感染 冻干保存南京 FhNJG1 1山羊自然感染 冻干保存甘肃 FhGSG1 1 山羊自然感染 冻干保存2.1.2主要试剂 PCR试剂（Buffer、MgCl2、dNTPs等）、Taq DNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker为TaKaRa产品；基因组抽提试剂盒，为上海生工有限公司生产；蛋白酶K为美国Merk公司产品；TEMED、溴化乙啶（E.B）为美国Sigma公司产品； 琼脂糖为上海YITO有限公司产品；MDE商品胶、Gel Slick Solution为BioWhittaker Molecular Application 公司产品。2.1.3溶液 5TBE贮存液（使用时，稀释成0.5工作液）：Tris碱54.0g硼酸27.5gEDTA (终浓度为0.5mol/L) 3.72g去离子水定容至 1000mlStop Solution（终止液）：formamide(95%)950lLoading buffer50lNaOH(10 mM) 1l 1ml 10的过硫酸胺溶液：将1g过硫酸胺加入10ml超纯水中，待其充分溶解，4保存，一周内使用。2.1.4主要仪器 QL-901 旋涡混合器：江苏海门市麒麟医用仪器厂；HH-W600 数显三用恒温水箱：广州市深华生物技术有限公司；TGL-16B 台式离心机：上海安亭科学仪器厂；WFH-201 型紫外分析仪：广州深华生物技术有限公司；凝胶图象分析系统：英国 UVITEC 公司；恒压恒流 DF-D11 型电泳仪：北京东方特力科贸中心；Bio-RAD 电泳系统：美国 Bio-Rad 公司；Biometra PCR 仪：德国 Biometra 公司；2l/20l/200l/1000l可调移液器为法国吉尔森公司产品。2.2方法2.2.1虫体处理（1）取出冻干保存的虫体，剪取一小部分组织，置于干净平皿中。（2）用单蒸水浸泡5分钟，然后再洗一遍。（3）取出虫体组织，置于新的1.5ml离心管中，用超纯水反复冲洗，然后将超纯水吸干净。（4）洗涤完毕，用剪刀剪碎，再用捣棒捣碎。2.2.2虫体的消化往离心管里加入200l的TE悬浮，再加入400l Cell Lysis Solution 混匀。然后加入6l 蛋白酶K混匀，置于55水浴箱中510分钟。期间上下混匀几次，使虫体组织充分裂解。延长消化时间到30分钟，效果更好。2.2.3虫体DNA的抽提（1）待水浴后，样品变为澄清液体无沉淀时，加入600l氯仿（自备）混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性。（2）台式离心机上，10000转/分，室温离心2分钟。此时应分为三层，基因组DNA在上层中，如未能分层，表明样品与氯仿未混匀。取500l上层清液，置于无菌1.5ml离心管中。（3）加入500l Precipitation Solution 混匀，室温放置2分钟。10000转/分，离心2分钟。（4）吸去上清，注意不要吸到沉淀，立即加入100l，1.2mol/L Nacl,轻轻震荡直至DNA样品完全溶解。（5）加入300l预冷无水乙醇（自备），20放置10分钟。10000转/分，离心58分钟。吸走或倒掉乙醇，用70乙醇洗一次，倒置室温干燥10分钟，注意不要让DNA干透。DNA用100l水或TE溶解。（7）将提取的DNA溶液转移到规格为0.5ml的离心管中，-20保存。2.2.4 ITS-1部分序列的PCR扩增（1）PCR引物：参照基因库中已发表的肝片吸虫ITS-1序列设计一对引物，序列如下：上游引物 NC5I：5CTCATTGAGGTCACAGCAT3下游引物 NC13IR：5CAATGGCAAAGAATGGCAAG3预期片段大小为245bp。（2）在0.2ml离心管中依次加入2.5l 10PCR Buffer(Mgcl2-free)、2l dNTPs(25mM)、正反向引物各0.25l、模板DNA 1l，最后加Taq DNA 聚合酶0.25l，用灭菌去离子双蒸水加至总体积25l，混匀，然后用PCR扩增仪进行扩增。 PCR 扩增体系：组分体积（l）ddH2O15.7510PCR Buffer(Mgcl2-free)2.5Mgcl2(25mM)3.0dNTPs(25mM of each)2.0NC5I0.25NC13IR0.25模板DNA1.0Taq Polymerase(5U/l)0.2525lPCR扩增条件：StepTem()Time194变性5分钟294变性30秒350复性30秒472延伸30秒5go to step 2 for 34 cycles6772延伸165分钟24小时（3）琼脂糖凝胶电泳：称取1克琼脂糖，加入100ml 0.5TBE，加热充分沸腾后冷却至50左右，加10l E.B，充分摇匀。倒入已封好的凝胶灌制胶模中，插上样品梳。待琼脂完全凝固后，谨慎小心地拔出梳子，再撕掉封带，然后放入电泳槽中，加入足够的电泳缓冲液。点样：取3l PCR产物与适量的加样缓冲液充分混匀，然后用取液器将样品加入点样孔中，同时设以适宜的DNA分子量标准物（marker）作为参照。电泳：接通电源，使DNA向阳极移动，在110V/cm凝胶的电压下（常用100V）进行电泳。当加样缓冲液的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。结果观察：将电泳好的胶置于紫外透射仪中，打开紫外灯，可看到橙红色的核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA对照，通过线性DNA条带的相对位置，可初步估计样品的分子量。如果结果比较满意，则用凝胶成像系统进行摄像，保存图像。2.2.5 Cold-SSCP分析（1）洗板：玻璃板先用NaOH（10M）处理12小时至24小时。再用稀硫酸（1）处理3小时，再用水浸泡半天（12小时）。（2）将处理过的玻板用双蒸水洗3次，每次擦干；然后用95酒精洗3次，每次擦干。最后用洁净的纸轻擦，要确保波板的倒胶面无尘、油脂、纸屑等，否则影响胶的质量。（3）在薄板的胶面涂上一层Gelstick（80l/块）。（4）将厚板和薄板合上，夹在架上备用，下面垫上橡皮。（5）配胶。在洁净离心管中依次加入3.9ml双蒸水、0.6ml 5TBE、1.5ml MD胶、31l 10过硫酸胺、3l TMD聚合胶。见表2。表2 Cold-SSCP胶（一块胶）成分体积双蒸水3.9ml5TBE0.6mlMD胶1.5ml10过硫酸胺31lTMD聚合胶3l（6）配胶后混匀，然后用1000l取液器取胶进行灌胶。注意不能有气泡，直至灌满。然后插入洁净的梳子，注意垂直插入。（7）凝胶6080分钟。拔去梳子，将胶放入胶架，插入内盒卡紧。灌入0.5TBE溶液至淹过内侧波板。观察是否有漏液。如有渗漏，则要重新卡紧，直至不漏（或者边上涂上凡士林）。（8）预电泳：每孔加入12l Stop Solution，预电泳10分钟。（9）样品准备：取之前扩增的PCR产物14l，加入Stop Solution 7l，混匀、离心；94变性5分钟，20速冻2分钟。（10）取速冻的样品20l加入每个孔，100V电泳34小时。前20分钟要观察是否漏液。（11）染色：电泳完毕后取下中间的胶，放入100ml 0.5TBE，加入10l E.B。染色50分钟，紫外透射仪下观察结果。2.2.6样品ITS-1全序列的扩增及测序以保守引物NC5和NC13R PCR扩增出ITS-1全序列，PCR产物送上海英骏生物技术有限公司以反向引物NC13R进行测序。上游引物 NC5： 5GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT3下游引物 NC13R： 5GCTGCGTTCTTCATCGAT3ITS-1全序列的PCR扩增体系：组分体积（l）ddH2O30.510PCR buffer(Mgcl2-free)5.0Mgcl2(25mM)6.0dNTPs(25mM of each)4.0NC50.5NC13R0.5Taq Polymerase(5U/l)0.5Total47混匀后分装，每管加3l DNA，快速混匀后，放PCR扩增仪中进行扩增。PCR扩增条件参见上述部分的ITS-1部分序列扩增条件。3 结果与分析3.1 ITS-1部分序列的PCR扩增以不同地区片形吸虫DNA为模板，以NC5I和NC13IR为引物，进行PCR扩增，PCR产物于1琼脂糖凝胶进行电泳，可见大小约为250bp的条带，与预期结果一致。无非特异性条带，空白对照为阴性，如图1所示。M 1 2 3 4 5 6 M图1 不同地区片形吸虫 ITS-1 部分序列的PCR产物电泳图M为DL-2000 DNA Marker；1.FgGXB1(广西)；2.FgGXB7(广西)；3. FgGZG1(贵州)；4.FhNJG1(南京)；5.FhGSG1(甘肃)；6.空白对照3.2 Cold-SSCP分析样品PCR产物进行Cold-SSCP电泳，结果见图2所示。根据Cold-SSCP带型，可将样品分为两种带型，来自广西的样品和贵州的的样品属于一种带型；来自南京和甘肃的样品属于另一种带型。 图2 不同地区片形吸虫 ITS-1 部分序列PCR-SSCP电泳图1.FhGSG1(甘肃)；2.FhNJG1(南京)；3.FgGZG1(贵州)；4.FgGXB7(广西)；5.FgGXB1(广西)3.3 ITS-1全序列的PCR扩增以样品的基因组为模板，以NC5和NC13R为引物，扩增ITS-1全序列。PCR产物于1琼脂糖凝胶中进行电泳，可见大小约500bp的特异性条带（图3），与预期目的片段大小一致。将样品的ITS-1全序列PCR产物送上海英骏生物技术有限公司直接测序。图3不同地区片形吸虫 ITS-1 全序列的PCR产物电泳图M为DL-2000 DNA Marker；1.FgGXB1(广西)；2.FgGXB7(广西)；3. FgGZG1(贵州)；4.FhNJG1(南京)；5.FhGSG1(甘肃)；6.空白对照3.5 测序结果和分析 样品测序结果与Cold-SSCP分析结果相符, 片形吸虫ITS-1序列全长422bp，有5个变异位点，用于Cold-SSCP分析的部分ITS-1序列包含了其中4个变异位点，根据变异位点可区分大片形吸虫和肝片形吸虫，两者在Cold-SSCP分析中显现不同的带型。样品FhNJG1 、FhGSG1测序结果显示属于肝片形吸虫；样品FgGXB1、FgGXB7 、FgGZG1测序结果显示属于大片形吸虫。4 讨论片形吸虫病在世界范围内流行，危害相当严重，不仅对畜牧业造成了巨大的经济损失，也威胁着人类的身体健康。其分类鉴定一直是研究的热点，传统的分类方法是以形态为主，结合生活史、流行病学等特征对虫体进行鉴别分类，这种方法的优点是简单易行。但因各种因素的影响，片形吸虫虫体个体差异大，形态有不规则的情况，以传统的方法对片形吸虫的分类鉴定存在一定难度。近年来，随着细胞学、分子生物学、分子遗传学的发展，学者们已经开始从细胞水平、分子水平探讨片形吸虫的遗传变异分类，应用的方法主要有限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）、聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、随机扩增多态性DNA分析(RAPD)、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）等等7-11，大大推进了片形吸虫分类学的研究进程。在研究序列片段的选择上，国内外许多的研究表明，ITS序列种内具有高度保守性，在不同种间又有不同程度的变异，是研究寄生虫分类鉴定及遗传变异的理想标记12-16。ITS是核糖体DNA（rDNA）中介于18S和28S之间的内转录间隔区，包括ITS-1和ITS-2两段序列，在片形吸虫的遗传学研究和种类鉴定中，ITS-2已被多次证明可作为片形吸虫种类鉴定可靠的遗传标记。对ITS-1序列在片形吸虫种间、种内的变异的研究尚较少，但在本研究之前，华南农业大学兽医寄生虫学研究室已建立了以ITS-1为靶序列用于片形吸虫分子鉴定的PCR-SSCP方法11，在此研究的基础上，本研究选取了ITS-1序列并改进了传统PCR-SSCP方法，建立了一种不需要同位素的片形吸虫的Cold-SSCP分子鉴定方法。传统的PCR-SSCP方法应用了同位素标记引物，并且要进行X光片的曝光、显影、定影等才能观察结果，程序较为繁复，且同位素对人体有一定危害，存在生物安全性问题。Cold-SSCP方法不使用同位素标记引物，采用溴化乙锭（E.B）染色的方法，简化了繁复的程序，提高了实验的安全性。本研究的Cold-SSCP电泳结果显示来自不同地区的片形吸虫样品分为两种带型，第一种为大片形吸虫的带型，第二种为肝片形吸虫的带型，样品的测序结果与Cold-SSCP结果相符。研究结果显示以核糖体DNA第二内转录间隔区（ITS-1）为遗传标记，结合Cold-SSCP方法能有效地鉴定大片形吸虫和肝片形吸虫虫。Cold-SSCP分析要取得良好效果，需要有足够量的PCR产物，但由于不使用同位素，Cold-SSCP具有简便，安全性高的优点，对实验者的人身安全有保障。本研究为片形吸虫种类鉴定分析的进一步研究奠定了基础，同时为片形吸虫病的鉴别诊断、分子流行病学调查以及本病的防治等更为深入的研究奠定基础。致 谢本研究是在指导老师朱兴全教授、林瑞庆老师的全面指导和亲切关怀下完成的，与此同时我院兽医寄生虫学教研室宋慧群老师、博士生李明伟、邹丰才，硕士生马妮妮在本实验过程中也给予了热心的帮助。本研究得到国家杰出青年科学基金项目（30225033）和华南农业大学大学生科技创新活动项目的资助。谨对上述的和未提及的有关人士表示最衷心的感谢！ 参 考 文 献1 李国清主编. 兽医寄生虫学.广东教育出版社，19992 黄维义,何波. 酶切图谱及序列分析虫体ITS2鉴别中国的片形吸虫. 动物科学与动物医学.2002，19(10)：2-63 Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, et al. 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