（黄秋明）论文两种氨基糖苷抗生素

两种氨基糖苷抗生素(庆大霉素和链霉素)抗体制备研究黄秋明 陈旭彦1.材料与方法1.1 主要材料1.1.1 试剂注射用庆大霉素（购于华农大校医院）动物用链霉素（购于华农大兽药厂）牛血清白蛋白（BSA）卵血清蛋白（OVA）弗氏完全佐剂（FCA）弗氏不完全佐剂（FIA）酶标羊抗小鼠NN二甲基甲酰胺（DMF）25%戊二醇、95%乙醇30双氧水(H2O2)马血清脱脂奶粉乙酸乙酯、NHS（N-酰基琥珀酰亚胺）、EDC（碳二亚胺）、丁二酸酐、硼氢化钠、MES、二氯甲烷、考马斯亮蓝、H3PO4、三乙胺1.1.2 主要仪器各种规格移液枪恒温磁力搅拌器4和20冰箱酶标仪紫外分光光度计电子天平恒温水浴箱冷冻离心机旋转蒸发仪1.1.3 其它材料 透析袋（新透析袋的处理：用蒸馏水煮沸10min，冷却至室温即可使用）96孔酶标板一次性注射器（1ml）离心管剪刀、镊子1.1.4 ELISA各种试剂的配制（1）包被液（0.1M、PH9.6碳酸盐缓冲溶液）：将0.636g Na2CO3和1.172g Na2HCO3加到200ml蒸馏水中，装入试剂瓶中4保存备用。（2）PBS贮存液（PH7.4，20倍）：4g KH2PO4, 58g Na2HPO412H2O, 4g KCl, 定容到1000ml，室温贮存。（3）PBST洗涤液（0.01M、PH7.4）：取上述配备的PBS贮存液100ml，加入17g NaCl，再加入1900ml蒸馏水，加入1ml Tween20，混匀，室温贮存，长期贮存期间出现浑浊，不能用，另配。（4）稀释液：取100ml PBST洗涤液，加入0.1g 明胶溶解，明胶比较难溶解，37水裕放置1小时，过滤即可，4下保存（一个星期内有效）。（5）底物缓冲液（PH5.0）：0.933g 柠檬酸，3.689g Na2HPO412H2O，定容到200ml，4贮存（1个月内有效）。（6）底物贮存液（发黄不可用）：80mg 邻笨二胺溶于10 ml底物缓冲液中，分装贮存（0.5ml/支），怕光，操作快速，-20贮存。（7）显色液：临用前现配，取0.5ml底物贮存液壁光快速解冻，加入9.5ml底物缓冲液，再加入16l 30过氧化氢（H2O2），立即用，用后剩余的丢弃。（8）终止液（10硫酸）：取10ml浓硫酸，加入到90ml蒸馏水中，室温贮存。（9）封闭液：2的马血清/5g脱脂奶粉+100mlPBS+0.8gNaCl1.2 实验内容1.2.1 抗原的合成（1）庆大霉素人工抗原：方法一（EDC法）：称取10mgBSA（免疫原载体）或OVA（包被抗原载体）溶于1ml蒸馏水中，然后加入32mg（0.8ml）庆大霉素得混合溶液A。称取EDC315mg溶于1ml蒸馏水中，得溶液B，最后将A、B混合，在室温下用磁力搅拌机轻柔搅拌3h后，将反应物取出，在透析袋中用0.9的生理盐水透析3天，每天换透析液3次。透析好的反应物分装后，保存于-20冰箱中。方法二（GDA法）： NHS丁二酸酯的制备：室温下搅拌3h、50ml乙酸乙酯萃取30ml二氯甲烷5gNHS + 4.35g丁二酸酐米白色固体7.2ml三乙胺溶液A25ml冰、1MHCl洗两次无水Na2SO4干燥 蛋白活化：NHS丁二酸酯溶解于DMF(10mg/ml)2mgBSA/OVA溶解于1mlPBS,调pH=7吸取120l室温下反应1.5h超滤（4，20分钟），渗余物中加1ml5mM-MES(pH5)加入200l（10mg/mlEDC）5mM-MES(pH5)缓冲剂加入200l（10mg/mlDHS）5mM-MES(pH5)缓冲剂加入1ml 5mM-MES(pH5)缓冲剂超滤（4，30分钟），得转化蛋白质加入1mlPBS离心2次室温反应2h,超滤（4，30分钟）活化蛋白（用PBS稀释至1mg/ml）反应完毕，将反应物取出，4下在透析袋中用0.9的生理盐水透析3天，每天换透析液3次。透析好的反应物分装后，保存于-20冰箱中。（2）链霉素人工抗原制备（GDA法）：2mg/mlBSA/OVA溶于0.1M-碳酸盐和0.15M-NaCl(pH)8.5，加入DHS获得2mg/ml浓度的产物，然后加入新鲜制备的1%的戊二醛，在4搅拌反应3h,然后加入一定量的硼氢化钠，4搅拌反应1h，反应完毕，将反应物取出，4下在透析袋中用0.9的生理盐水透析3天，每天换透析液3次。透析好的反应物分装后，保存于-20冰箱中。（3）在实验过程中进行了抗原方法的交叉试验，即尝试是否能制备出庆大霉素EDC抗原、庆大霉素GDA抗原、庆大霉素acc抗原；链霉素EDC抗原、链霉素GDA抗原、链霉素acc抗原。1.2.2 免疫抗原和合成抗原的合成按照上述两种方法，分别用BSA（牛血清白蛋白）和OVA（卵血清蛋白）作为载体蛋白，合成完全抗原。其免疫抗原分别为庆大霉素BSA和链霉素BSA，其包被抗原分别为庆大霉素OVA和链霉素OVA。1.2.3 完全抗原的鉴定 将合成的完全抗原、载体蛋白和原药按照合成的比例分别稀释到合适的浓度，然后分别对其进行紫外分光扫描，比较其图谱，分析其偶联效果。1.2.4 考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度 取6支试管，按下表数据配制01000l/mL 牛血清白蛋白溶液各1mL 管 号试 剂1234561000l/mL牛血清白蛋白溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20蛋白质浓度（l/mL）02004006008001000 准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入10mL具塞试管中，再加入5mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用10mm光径的比色杯在595nm下比色，作出标准曲线。 将合成的抗原稀释到一定浓度后按上法与考马斯亮蓝溶液反应，测定其OD值，并将测定的OD值代入标准曲线中以求出合成抗原中蛋白质的浓度。1.2.5 抗体的制备1.2.5.1 佐剂和免疫抗原的混合 将人工抗原慢慢解冻，根据完全抗原的实际浓度取出一定量，使其溶液中至少含有蛋白质100g，然后加入等量的弗氏佐剂（第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂），混合物在旋涡混合器上充分振荡混合至W/O状态。1.2.5.2 动物实验 选择6只健康的Balb/c小白鼠（3只免疫庆大霉素，3只免疫链霉素），做好标记后饲养于动物房中，并按下表对小白鼠进行药物免疫。免疫次数免疫时间免疫原免疫剂量免疫部位1免疫抗原和等量弗氏完全佐剂混合100g蛋白质腹部、腿部肌肉2第1次免疫后两周免疫抗原和等量弗氏不完全佐剂混合100g蛋白质腹部、腿部肌肉3第2次免疫后18天同上100g蛋白质腹部4第3次免疫后三周同上100g蛋白质腹部5第4次免疫后三周同上100g蛋白质腹部1.2.5.3 血清的制备用70的酒精对剪刀和镊子进行消毒，同时用沾了酒精的棉花球对小白鼠的尾部末端进行消毒，用消了毒的剪刀剪下小白鼠尾部的末端，然后用4mL的离心管进行采血，采血后马上进行离心处理，然后把离心后的血液放置在4冰箱中静置3个小时，取上层血清分装保存于20冰箱中。1.2.6 ELISA法检测抗体的抑制性抗生素间接竞争ELISA法的原理：将抗生素分子和大分子载体蛋白质偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体上，然后加入待测抗生素和相应的抗体，固相载体上的抗生素就和待测抗生素竞争与血清中的抗体反应。待测抗生素含量高，则被结合在固相抗原上的抗体就少，反之，结合在固相抗原上的抗体就多。反应后加入酶标二抗，最后通过底物显色测定OD值。当抗体的量一定时，加入的待测抗生素量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高。反之，发色反应增强，抑制率降低。1.2.6.1 包被抗原（1）分别取一定量的庆大青霉素OVA和链霉素OVA，用包被液稀释成1.0、2.0l/ml 二个浓度。（2）将稀释后的抗原溶液以100l/孔加入到酶标板上，4冰箱中放置过夜。（3）取出，甩干，用PBST洗涤液洗3次，拍干（4）加入封闭液200l/孔，水浴中放置3h，甩干后用蒸馏水洗涤3次，然后放置于烘箱中2h。1.2.6.2 抗血清药效的测定（1）根据配制药物稀释液。（2）将动物血清稀释500倍。（3）先在一块空板（未经包被，用蒸馏水洗涤一次，甩干）里依次加入75l 原药标液，再在每孔均加入75l 经稀释（倍比稀释）的血清，37温箱中孵育1h，让原药与血清先在空板上充分反应。（4）把空板中的液体转移到包被板上，37温箱中孵育1h。（5）蒸馏水洗涤3次，甩干，加入酶标二抗（1：6000），37温箱中孵育1h。（6）蒸馏水洗涤3次，甩干，加显示液，37温箱中显色15min，加入终止液。（7）酶标仪测定OD值。2 实验结果与分析2.1 免疫抗原紫外分光扫描2.1.1 庆大霉素EDC紫外分光扫描图1.BSA（黑色）、庆大霉素（蓝色）、庆大霉素EDC（绿色）由上图可以看出，绿色和黑色曲线几乎完全重合，即是.BSA（黑色）、庆大霉素EDC（绿色）两者重合，所以不能很好地判断偶连是否成功，需要作进一步试验检测合作其他方面的验证，如进行质谱分析。2.1.2 链霉素EDC紫外分光扫描图2 BSA（黑色）、庆大霉素（蓝色）、庆大霉素EDC（绿色）由上图可以看出，绿色和黑色曲线几乎完全重合，即是.BSA（黑色）、链霉素EDC（绿色）两者重合，所以不能很好地判断偶连是否成功，需要作进一步试验检测合作其他方面的验证，如进行质谱分析。从紫外扫描图谱看，如果合成的完全抗原的图谱与载体蛋白、半抗原的图谱都有所不同，同时，完全抗原最大吸收峰波长与载体蛋白、半抗原的比较也不同，这说明合成的产物是不同于载体蛋白和半抗原的物质，也就是载体蛋白和半抗原的复合物。从图谱上可以看出，庆大霉素BSA的图谱和链霉素与BSA偶联效果不够明显，因此下一步的实验也存在一定的不确定性。2.2 考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度 考马斯亮蓝标准曲线如下图所示：图3 考马斯亮蓝蛋白质标准曲线由上图可得回归方程：y=0.009x,x为蛋白质浓度，y为吸光值。则有：庆大霉素BSA的OD值为0.687，则其蛋白质浓度为763.333g/mL链霉素BSA的OD值为0.846，则其蛋白质浓度为940.000g/mL庆大霉素OVA的OD值为0.709，则其蛋白质浓度为787.778g/mL链霉素OVA的OD值为0.623，则其蛋白质浓度为692.223g/mL2.3 ELISA法检测抗体的抑制性2.3.1 庆大血清检测2.3.1.1 检测1g/ml的药物（用1g/ml的包被浓度）表1庆大霉素EDC血清检测结果（1g/ml）血清稀释倍数500X1000X20000X40000X80000X160000X32000X64000X加药物（1g/ml）1.0010.6180.4740.3210.1710.1150.110.065不加药物1.5061.0910.7270.5120.2720.1620.1110.053图4 庆大霉素EDC血清检测血清稀释倍数由上图可知，庆大霉素EDC血清通过添加药物和不加药物的对照实验，发现两者的吸光值有明显的差距，不加药物的血清吸光值均比加药物的强，说明血清中含有庆大霉素EDC抗体。2.3.1.2检测1g/ml的药物（用1g/ml的包被浓度）表2庆大霉素GDA血清检测结果（1g/ml）血清稀释倍数400X800X1600X3200X6400X12800X256000X加药物（1g/ml）0.5910.5030.3920.2440.1820.1270.101不加药物0.7130.5940.4310.2970.2550.1360.105阴性血清0.0500.050.0450.0390.0440.0400.040图5 庆大霉素GDA血清检测由上图可知，庆大霉素GDA血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血清的检测排除系统误差，发现两者的吸光值有一定的差距，不加药物的血清吸光值均比加药物的强，但是由于吸光值都不是很大，最大只有0.713，而且加药物和不加药物的差距并不是很大，说明血清中可能含有庆大霉素GDA抗体。2.3.1.3检测1g/ml的药物（用1g/ml的包被浓度）表3庆大霉素acc血清检测结果（1g/ml）血清稀释倍数50010002000400080001600032000加药物（1g/ml）0.2630.1920.1260.0790.0720.0550.047不加药物0.3170.2040.1360.0750.0600.0480.043阴性血清0.0560.0570.0520.0470.0460.0460.0386图 6 庆大霉素GDA血清检测由上图可知，庆大霉素GDA血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血清的检测排除系统误差，发现两者的吸光值有差距，但是由于吸光值都不是很大，最大只有0.713，而且加药物和不加药物的差距并不是很大，有可能是系统误差，因此不能确定血清中是否含有庆大霉素GDA抗体。 从以上3种制备庆大霉素抗体方法的数据和直观图可以看出，通过EDC方法制备的庆大霉素抗原在动物（小鼠）体内获得了免疫反应，在血清鉴定当中有较明显的效果。但是GDA、ACC两种方法并没有取得很好的效果，需要进一步检测。因此，初步判断EDC方法是可行的，下一步工作将是EDC方法的重复验证和和优化。 2.3.2 链霉素血清检测2.3.2.1检测1g/ml的药物（用1g/ml的包被浓度）表4链霉素EDC血清检测结果（1g/ml）血清稀释倍数5001000200040008000160003200064000加药物（1g/ml）0.2350.1890.1380.1110.1180.0840.0580.052不加药物0.2590.2240.2050.1250.1010.0810.0730.047图7 链霉素EDC血清检测阴性血清0.0530.056.0500.0450.0440.0480.0540.054由上图可知，链霉素EDC血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血清的检测排除系统误差，发现两者的吸光值有一定的差距，不加药物的血清吸光值前4个点比加药物的强，但是后4个点反而比加药物的弱，而且吸光值都不是很大，最大只有0.235，而且加药物和不加药物的差距并不是很大，完全可以认为是系统误差造成的，说明血清中可能含有链霉素EDC抗体，即需要改善各种条件，作进一步检测，如果检测结果均没有很好的效果即可判定此方法不可行。2.3.2.2 检测1g/ml的药物（用1g/ml的包被浓度）表5 链霉素GDA血清检测结果（1ug/ml）血清稀释倍数5001000200040008000160003200064000加药物（1g/ml）1.5221.4431.1460.9080.5280.4680.2610.067不加药物1.6371.4661.3321.0720.5810.5490.3570.067阴性血清0.0530.056.0500.0450.0440.0480.0540.054图 8 链霉素GDA血清检测由上图可知，链霉素GDA血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血清的检测排除系统误差，发现两者的吸光值有一定的差距，不加药物的血清吸光值均比加药物的强，吸光值最大有1.637，总体吸光值较大，而且加药物和不加药物有一定差距，说明血清中可能含有链霉素EDC抗体，但仍需要改善各种条件，作进一步检测。2.3.2.3 检测1g/ml的药物（用1g/ml的包被浓度）表6链霉素acc血清检测结果（1g/ml）血清稀释倍数500100020004000800016000加药物（1g/ml）0.3690.2880.1690.1330.0980.083不加药物0.4560.3780.2100.1250.0960.069阴性血清0.0650.0550.0510.0520.0600.052图9 链霉素acc血清检测由上图可知，链霉素acc血清通过添加药物和不加药物的对照实验，另外通过阴性血