DNA的重组与转座 (2).ppt

第6章DNA的重组与转座Chapter6DNARecombinantandTransposition,2013.10.29,1、通常DNA自发变化都是通过作用很快被校正，但在极少情况下，DNA将变化的部分保留下来导致永久的序列变化，称为：。2、DNA复制过程中发生的DNA变化称为。损伤的修复方式有;,其中以为主。,填空,DNA修复,突变,损伤,错配修复,直接修复,切除修复,重组修复,SOS系统,切除修复,1、紫外线照射对DNA分子的损伤主要是:()A.碱基替换；B.磷酸酯键断裂；C.碱基丢失；D.形成共价连接的嘧啶二聚体。,选择,D,2、比较真核生物与原核生物的DNA复制,二者的相同之处是：()A.引物长度较短；B.合成方向是53；C.冈崎片段长度短；D.有多个复制起始点；E.DNA复制的速度较慢(50dNTP/s).,B,3、着色性干皮病是人类的一种遗传性皮肤病,患者皮肤经阳光照射后易发展为皮肤癌,该病的分子机理是：()A.细胞膜通透性缺陷引起迅速失水;B.在阳光下使温度敏感性转移酶类失活;C.因紫外线照射诱导了有毒力的前病毒;D.细胞不能合成类胡萝卜素型化合物;E.DNA修复系统有缺陷。,E,6,6.1同源重组6.1.1同源重组的分子模型6.1.2异源双链与基因转换6.1.3细菌基因转移与重组6.1.3.1细菌的接合作用6.1.3.2遗传转化6.1.3.3细菌的转导6.1.3.4细菌的细胞融合6.2DNA重组技术6.3特异位点重组6.3.1噬菌体DNA整合与切除6.3.2细菌的特异位点重组,6.4DNA的转座6.4.1转座子的概念6.4.2转座子的分类6.4.2.1插入序列(IS因子)6.4.2.2复合转座子(Tn)6.4.3转座子转座的机制6.4.4转座子转座的特征6.4.5转座引起遗传学效应6.4.6真核生物的转座因子6.5逆转录转座子6.4.1逆转座子的结构特点6.4.2逆转座子的作用机制6.4.3逆转座子的生物学意义,第六章DNA的重组与转座,7,重组的概念：DNA分子内或间发生遗传信息的重新组合，称遗传重组（染色体水平）或基因重排(分子水平)。重组产物称为重组DNA(recombinantDNA)。DNA重组对生物进化起关键作用。进化以不断产生可遗传的变异为基础，首先是突变和重组，由此产生遗传变异，然后才有遗传漂变和自然选择，才有生物进化。重组的意义：能迅速增加群体遗传多样性，使有利与不利突变分开，通过优化组合积累有用的遗传信息。重组参与许多重要生物学过程，为DNA损伤或复制障碍提供修复机制。某些生物的基因表达受到重组调节。,8,同源重组及其分子模型概念：由两条同源区DNA分子通过配对、链断裂和再连接，产生片段间交换的过程。Holliday模型（能解释同源重组现象）四个关键步骤：两个同源染色体DNA相互靠近并排列整齐；在同一部位两条单链断裂，引发重组；断裂的单链游离端彼此交换，每条链与另一对应链连接，形成Holliday中间体;分支迁移产生异源双链。两分子间交点沿DNA移动，方向任意。,9,两个同源染色体DNA排列整齐；两分子同一部位两个单链断裂，引发重组；断裂后形成单链3游离端，后者侵入到双链DNA内，寻找同源区域并配对结合，产生短的链置换区；断裂单链游离端彼此交换，每条链与另一对应链连接，形成Holliday中间体,10,通过RuvA和RuvB引发分支迁移，产生异源双链DNA；通过RuvC形成拆分口，将四链DNA复合体按不同方向拆分，形成片段重组体和拼接重组体。,12,Holliday中间体通过分支移动产生异源双链DNA。异构化后通过不同切割方式产生不同重组分子：如果切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA，称拼接重组体（左），但如切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，称片段重组体（右）,13,14,同源重组的过程很精确，一个核苷酸的差错都会造成基因失活。同源重组的分子基础是DNA链间配对，通过碱基配对才能找到正确的位置进行链交换。实验表明，两个DNA分子必需具有75bp以上的同源区才能发生同源重组，小于此数值时将显著降低重组率。,同源重组的酶学分子基础：RecBCD途径：起始于对重组DNA分子中的一条双链DNA进行双链切断。RecBCD蛋白(RecB、RecC和RecD基因的产物)结合到DNA双链断裂位点，并利用RecBCD蛋白本身具有的DNA解旋酶活性，向具有5-GCTGGTGG-3序列的Chi位点进行DNA解旋。,15,16,(1)Chi位点和RecBCD核酸酶原核生物有许多引发重组的方式Chi位点能激发重组：存在于大肠杆菌的Chi位点,含非对称8bp序列（5-GCTGGTGG-3）每510kb出现一次.当：1）DNA以游离单链3端形式存在时【辐射损伤、基因组经滚环复制产生】2）噬菌体的一些突变体，3）单一碱基对的改变都能产生激发重组的Chi位点。,17,Chi位点是基因recBCD编码的RecBCD酶作用靶位.RecBCD是多功能酶，有三种活性：依赖ATP核酸外切酶活性；可被ATP增强的核酸内切酶活性；ATP依赖的解螺旋酶活性。,18,当DNA分子断裂，RecBCD即结合在游离端，使双链解旋并降解;酶移动到Chi位点3侧46个nt，将链切开，产生3游离单链端。3游离单链端引发异源双链形成。RecA在3端与同源双螺旋序列反应产生交联分子。,在E.coli基因组中平均每5000bp就有一个Chi位点。RecBCD蛋白还具有外切双链和单链的活性，也具有单链内切核酸酶活性。使RecBCD蛋白可产生3单链末端，该末端能被RecA蛋白和SSB包裹。RecBCD蛋白也协助RecA装载到3-DNA末端。RecA蛋白使单链末端侵入到其它双链DNA内，寻找能配对的同源区域，进而配对结合，当配对区间延伸扩展，产生链置换区-（分支迁移）。,19,分支迁移实际上是在RuvC作用下，两条DNA分子之间交叉的同源单链互相置换的结果，迁移方向可朝向DNA分子的任意一端。因此，在重组区段每条双链中均有一段DNA单链来自另一个双链中的相对链，这一部分称为异源双链（heteroduplex）。,20,RecBCD蛋白能产生3末端并发动该末端侵入双链DNA的过程依赖于ATP和Mg2+两种物质的相对浓度。机制如下：RecBCD蛋白首先结合在双链DNA上并使之解链；,21,当ATP浓度大于Mg2+浓度时，大部分Mg2+被ATP螯合。RecBCD蛋白的解旋酶活性向着Chi位点方向打开DNA双链，形成有3末端的凸形DNA结构。当RecBCD到达Chi位点，就切割Chi位点下游的核苷酸，且由RecA蛋白包裹环凸的DNA，RecBCD继续解开DNA螺旋，形成3端覆盖着RecA蛋白的单链3末端；,22,当Mg2+浓度大于ATP浓度时，大量Mg2+未被螯合，RecBCD蛋白解旋酶活性同样向着Chi方向打开DNA双链，形成有3末端的凸形结构，在环后降解DNA，当RecBCD蛋白到达Chi位点时，RecA蛋白结合到环突DNA上，RecBCD停止降解3末端。开始切割5末端的链，并激活53外切核酸活性，降解5端的链，最终留下一个覆盖着RecA的单链DNA。,23,Chi位点在细菌中通常不存在大量双螺旋DNA的交换，而是有许多其它引发重组的方式。一些情况下，DNA以游离单链3末端的形式被用于重组，如DNA的辐射损伤可产生单链，噬菌体基因组经滚环式复制也能产生大量单链。研究发现在噬菌体的一些突变体中单一碱基对的改变就能产生激发重组的一些位点，如Chi位点。这些位点都含有一个恒定的非对称的8bp序列（5-GCTGGTGG-3），该序列天然存在于E.coli的DNA中，大约每510kb长的序列中即可出现一次。,RecA蛋白38kDa，与SSB一起结合于单链DNA形成螺旋纤丝。此复合物可与双链DNA作用发生部分解旋以便识别碱基，迅速扫掠寻找与单链互补的序列。互补序列一旦被找到，双链进一步被解旋，从而转换碱基配对，使单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来。,25,RecA有两个主要功能：诱发SOS反应；促进DNA单链与同源双链发生链交换，使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以进行。当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上形成螺旋状纤丝。,26,27,RuvAB复合物结合在Holldiay中间体,Ruv蛋白由于DNA分子是螺旋结构，在持续进行链交换时要发生分子旋转。RuvA和RuvB蛋白共同构成了DNA解旋酶。RuvA四聚体有平面对称的四方形结构，能识别Holliday中间体的交叉点，RuvB利用其ATP酶的水解活性而驱动DNA解螺旋和分支移动，在移动的后方又重新形成螺旋。,RuvC蛋白RuvC蛋白是一种核酸内切酶，同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开，并由DNApol和DNA连接酶修复合成。RuvC特异识别Holliday联结体并将其切开，它识别不对称的四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热点，并决定重组结果是片段重组体还是拼接重组体，即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。,28,29,Holliday模型缺陷：重组的两个DNA在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。但一般单链断裂经常发生，两个分子在同位置发生断裂几率有限。,30,Moselson认为同源分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一分子同源区，造成链置换。侵入链留下的缺口由聚合酶补上，被替代的链被降解，它的残留末端与最初断链连接，形成中间体。,31,更多研究表明，重组由双链断裂启动，两同源分子之一发生双链断裂，经核酸酶和解螺旋酶作用，产生具3末端单链，它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对。相对应链则被置换，与原断裂链配对。经修复合成、链的再连接，形成两个交叉，而非单链交换的一个交叉。,32,只有当两条DNA有75bp以上同源区时，才发生同源重组，小于此值，重组率显著降低同源性并不意味序列完全相同。两DNA只要含有一段碱基序列类似的同源区，就可发生重组。现在认为，DNA双链断裂才能与同源分子发生链交换，将同源染色体分配到子代细胞，同源重组是减数分裂的原因，而非结果。因此双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。,33,相当于原核中与重组有关酶的对应物在真核中也已发现。酿酒酵母的rad51基因与大肠杆菌recA基因同源，二者功能相关。该基因的突变造成双链断裂积累，且无法形成正常的联合复合物，但此蛋白不能在体外与单链DNA形成纤丝，表明原核与真核的同源重组机制可能不同。,34,特异位点重组广泛存在于各类细胞，有关主要过程：某些基因表达的调节；发育过程中程序性DNA重排；有些病毒和质粒复制中发生的整合与切除。特点：1）一般发生在特定短序列（重组位点），（20200bp）内。2）有特异酶（重组酶）和辅因子识别作用。,35,特异位点重组的结果决定于重组位点的位置和方向：重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上，重组结果发生倒位；重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组发生切除；重组位点在不同分子上，重组发生整合。,36,重组位点方向相反的存在于同一DNA分子重组结果发生倒位；【原来的两个位点交换】,37,重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组发生切除；,38,重组切除【只在原DNA分子上留下一个位点，另一位点移到原重组位点之间的那一段序列，形成另一个DNA分子】,39,噬菌体DNA的整合与切除DNA进入E.coli有溶源和裂解两条途径，初始过程都要求早期基因表达，为两条途径歧化作准备。之后的两种生活周期选择取决于CI和Cro蛋白相互颉抗的结果。CI蛋白抑制除自身外所有噬菌体基因转录，CI蛋白占优势，则进入溶源状态。Cro蛋白抑制CI基因转录，Cro蛋白占优势时，噬菌体进入繁殖周期，宿主细胞裂解。,40,DNA的整合发生在噬菌体和宿主染色体的特定位点，是一种特异位点重组。整合的原噬菌体随宿主染色体一起复制并传递给后代。但在紫外线照射或升温等因素诱导下，原噬菌体可被切下，进入裂解途径，释放噬菌体颗粒。,41,噬菌体与宿主的特异重组位点称附着位点。噬菌体附着位点（attP）240bp，细菌相应的附着位点（attB）23bp，二者含共同核心序列15bp(O区）,A.为整合和切除过程B.为共同的核心序列,DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。这些酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。,重组DNA技术,重组DNA技术,（1）目的DNA的获得;（2）目的DNA与载体的连接;（3）重组子导入受体细胞;（4）重组子的筛选和鉴定;,限制性内切酶的发现,能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。,限制性内切酶的发现,阿尔伯WernerArber瑞士巴塞尔Biozentrum大学1929年-,内萨恩斯DanielNathans美国霍普金斯大学医学院1928年-1999年,史密斯HamiltonO.Smith美国霍普金斯大学医学院1931年-,荣获1978年诺贝尔生理学或医学奖限制性核酸内切酶的发现及其在分子遗传学中的应用,限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。,限制性内切酶,限制性内切酶的命名原则,命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I,II,III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。,属名+种名+株名+流水号流感噬血杆菌d株（Haemophilusinfluengaed）HindHindHind5AAGCTT3Hind3TTCGAA5,EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上。,命名,Hind,Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,限制性内切酶分类,限制性核酸内切酶可分为三大类：I类II类*III类,I类限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。代表EcoB、EcoK,II类(型)限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序(palindrome)，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。,GAATTCCTTAAG,EcoRI,III类(型)限制性内切酶,有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值。,限制性内切酶产物,钝端（平端）粘性末端,几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端,酶切反应,1）加入DNA；2）加入Buffer；3）加入酶；4）37保温1hr或过夜；5）反应终止，65加热、加入EDTA、或加入苯酚。,浓缩的限制性内切酶用1限制酶缓冲液稀释。限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20是稳定的。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20冰箱。尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。在切割大量DNA时，通常延长时间可使所需的酶量减少。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。注意星号酶切活力。,酶切反应,星号活性：限制性内切酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性降低，即可以把原来识别的特定的DNA序列不同的碱基切断。星号活性出现的频率、根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都有星号活性。,DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a.DNA的粘性末端;b.DNA的平末端;c.化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（Vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。,载体（Vector）,理想载体的基本条件：,可转移性;合适的复制位点;多克隆位点：广泛、特异;选择标志，便于筛选和鉴定;分子较小，可容纳较大的外源DNA。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,重组DNA的主要载体,质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体并能自主复制的遗传成份，绝大多数质粒都是由环形双链DNA组成的复制子。,质粒载体特点,1、至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2、至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3、至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。,遗传标记基因,标记基因的作用:1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞;这种指示可以是选择性的（Ampr，Tetr，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ）2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。,重组DNA载体的选择,选择载体的几个重要参数（1）实验对象（2）实验性质（3）载体容量（4）合适克隆位点（5）载体的稳定性（6）载体DNA制备的难易（7）外源基因表达产物产量、产物特点等,载体容量M13mp载体4kb细菌质粒载体10kb载体23kbCOS质粒载体48kbP1载体95kbpYAC载体1000kb合适的克隆位点单克隆位点和多克隆位点,载体分类,按功能分1.克隆载体;2.表达载体.按宿主性质1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬菌粒、噬菌体、噬菌体M13等2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、昆虫杆状病毒3.穿梭载体,常用质粒载体1.pBR322、pUC18/19、pUC118/119、pGEM、pBluescript、pBluescriptSK/KS等2.pET、pGEMEX、pGEX等3.pALTER等常用质粒宿主HB101、DH5、TG1、JM系列等BL21（DE3）等,转化(transformation):质粒及重组质粒;转染(transfection):病毒及重组病毒;转导(transduction):噬菌体及重组噬菌体;感受态:受体细胞处于易于接受外源DNA的状态.原理:（1）遗传物质的传递（2）受体菌的选择与改造,重组DNA转入受体细胞,转化方法,CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,1.遗传检测法,1）抗药性标志的选择,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,平板,2）标志补救（-半乳糖苷酶法）,77,DNA的转座概念转座子(transposons)是基因组中可移动的一段DNA序列。转座子由基因组的一个位置移到另一个位置的过程称为转座，促进转座的酶称转座酶。基因组中DNA序列基本恒定，在进化中，基因组缓慢发生变异。转座子引起基因序列改变，是基因组变异的一种重要方式。,78,转座特征：能从基因组的一个位点转移到另一位点，从一个复制子转移到另一复制子；不以独立形式存在(如噬菌体或质粒)，而在基因组内由一个部位直接转移到另一部位；转座子编码自身转座酶，每次移动携带转座必需基因一起在基因组内跃迁，又称跳跃基因；转座频率很低且插入随机，不依赖转座子(供体)和靶位点(受体)间序列同源性；转座子可插入到一个结构基因或调节基因序列内，引起基因表达产物改变。,79,转座子由B.McClintock于上世纪40年代在玉米遗传研究中发现，当时称控制元件。60年代后期，在大肠杆菌中发现一种由插入序列引起的多效突变，之后又发现一系列可转移的抗药性转座子，才重新引起重视。1983年McClintock被授予诺贝尔生理与医学奖，离她公布玉米控制因子时隔32年。转座子存在于所有生物体，人类基因组有35以上的转座子序列，其中绝大部分与疾病有关。研究转座子可使我们从分子水平上认知许多尚未弄清楚的生物学问题。,80,转座子的分类1.简单转座子(插入序列)(insertionsequenceIS）最简单转座子称插入序列,lS，已发现有10余种IS，如：IS1、IS2等。IS属较小转座子，长7501550bp，只含与转座有关酶基因，不含抗药性等其它基因，两端具有1525bp反向重复序列IR。,81,IS因子本身无表型效应，只有当转座到某一基因附近或插入某基因内部，引起该基因失活或产生极性效应时，才能判断其存在。所引起的效应与其插入位置和方向有关。IS可独立存在，也可作为其它转座子的组成部分。IS因子是细菌染色体和质粒的正常组分，一个大肠杆菌标准株含小于10个拷贝的IS因子。通常用双冒号表示一个特殊位点的插入，如：,82,转座酶活性是识别靶部位和转座子末端，并引起转座。转座子末端可视为转座酶的部分底物，转座酶水平的改变能控制转位因子的转位频率。,83,2.复合转座子转座子中间有药物抗性基因(或其它相关基因)标志，两侧(左右臂)是长末端重复序列或高度同源IS序列。复合转座子用Tn表示，如Tn5、Tn10等。根据结构不同Tn分两种类型：I型：两末端由相同IS构成，IS有正反向两种方式；II型：两末端由短反向重复(2040bp)组成，如TnA。,转座机制所有转座子都有在基因组中增加其拷贝数的能力，以两种方式发生：一种是通过在转座过程中转座子的复制；另一种是从染色体已完成复制的部位转到尚未复制的部位，然后随着染色体再复制。非复制型的转座子借助后一种方式扩增。,84,85,转座引起的遗传学效应发现转座子是它能导致突变【直接效应】突变在转座子被切除后恢复；引起宿主染色体DNA重组，造成断裂、重复、缺失、倒位及易位等，是基因突变和重排的重要原因；通过干扰宿主基因与其调控元件间的关系或转座子本身的作用而影响邻近基因表达，改变宿主表型。,86