DNA重组技术.ppt

重组DNA技术RecombinantDNATechnology,重组DNA技术的发展史,1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1985年K.Mullis的聚合酶链式反应技术1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉,第一节重组DNA技术概述OverviewofRecombinantDNATechnology,一、重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆,克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一）“克隆”就是获得遗传背景完全相同的分子或个体的“拷贝”,技术水平：分子克隆(molecularcloning)即DNA克隆生殖性克隆(动物克隆)治疗性克隆,DNA克隆(DNAcloning)通过一系列操作在体外获得大量相同DNA分子的技术，也称分子克隆(molecularcloning)或重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)。,（二）分子(DNA)克隆可以产生大量相同的DNA分子,利用分子克隆手段,可以获得大量相同的DNA分子,这主要基于DNA分子能构建到克隆载体中形成重组DNA分子,并在宿主细胞中复制,通过这种方式,重组DNA被扩增。,二、重组DNA技术是在体外利用酶对DNA进行重组的操作,重组DNA技术(recombinantDNAtechnology),即在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来源的DNA片段转移到能自主复制的遗传元件(又称载体)中,形成重组的DNA分子,并在宿主细胞中增殖。这种复制基因或DNA片段以产生相同DNA分子“拷贝”的技术，称为重组DNA技术或DNA克隆。又称分子克隆、基因克隆、基因工程或遗传工程。,以质粒为载体的DNA克隆过程,目录,第二节重组DNA技术常用分子工具MolecularToolsinRecombinantDNATechnology,一、工具酶在重组DNA技术中具有特殊的用途,限制性内切核酸酶DNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,目录,（一）限制性内切核酸酶是重组DNA重要的工具酶,定义:限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,BamH,作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类、（基因工程技术中常用型）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名,Hind,Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,BamH,+,Bst,同尾酶（isocaudarner）有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatibleend)。,BamH,Bgl,+,+,（二）连接酶可将具有配伍末端的DNA片段共价连接,连接酶的作用机制,（三）构建重组DNA分子还需要其他工具酶,碱性磷酸酶能去除DNA分子的5-磷酸基DNA聚合酶和核酸外切酶用于修剪限制性片段的末端脱氧核苷末端转移酶用于DNA分子加尾以构成粘性末端,将粘性末端转变成钝性末端,3,对5-粘性末端片段，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，在3OH端延伸，可填平末端的凹陷并将其转变成钝性末端。,将粘性末端转变成钝性末端,CTGCA,C,G,3,对3粘性末端的片段，应用如T4DNA聚合酶的35的核酸外切酶活性可切去未配对的序列，将其转变成钝性末端。,核酸外切酶,3,5,3,5,5,3,3,5,3OH,GGG,GG,dGTP,末端转移酶,末端转移酶加尾,二、克隆载体可容纳外源DNA且具有自我复制能力,载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA,克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准,能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；应有高的拷贝数。,1.质粒(plasmid),特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,目录,pBR322的物理图谱,目录,噬菌体DNA改造系统gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,2.噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,3.粘性质粒(cosmid),酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他,三、宿主细胞为重组的DNA分子提供扩增、筛选和表达的场所,宿主细胞（hostcells）是重组分子进行繁殖的场所。理想的宿主细胞通常是DNA或蛋白质降解系统缺陷株或重组酶缺陷株，因而具有较强地接纳外源DNA的能力，保证外源DNA能长期、稳定地遗传或表达。,第三节DNA克隆DNACloning,重组DNA技术基本原理,以质粒为载体的DNA克隆过程,目录,一、DNA克隆的核心过程是构建重组DNA分子,（一）构建重组载体产生DNA杂合分子,1.根据目的选择适宜的克隆策略2.通过限制性内切酶水解载体及外源片段产生配伍末端（1）限制酶水解载体使成为线性分子（2）根据目的选择外源DNA的来源（3）限制性内切酶水解外源DNA片段以产生与载体配伍的末端,3DNA连接酶将载体DNA与外源DNA连接,(1)粘端连接(2)平端连接(3)同聚物加尾连接(4)人工接头(linker)连接,同一限制酶切位点(单酶切)连接,不同限制酶切位点(双酶切)的连接,EcoR切割位点,Bgl切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目录,平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,目录,同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,目录,（二）重组分子可通过扩增、筛选与分离鉴定而获得,1.将重组DNA导入宿主细胞有转化、转染和感染几种方法将外源DNA转入细菌的过程称转化(transformation)将外源DNA直接转入动物细胞的过程称转染(transfection)采用包装病毒将外源DNA转入细胞的过程称感染(infection),2标志筛选和序列分析可用于重组子的筛选和鉴定,（1）质粒的抗性基因是转化菌的筛选标志（2）用插入失活筛选重组子（3）标志补救(markerrescue)是筛选转化酵母的常用方法（4）限制性图谱和核酸序列分析可直接鉴定外源DNA,(插入失活法)抗药性标记选择,目录,互补,pBR322,互补的检测,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,目录,二、利用重组DNA技术可分离、克隆单个基因,（一）候选基因有染色体DNA和cDNA两种来源待克隆DNA的来源可以是染色体DNA，也可以是cDNA。这需根据实验目的进行选择。如果对蛋白质的氨基酸序列感兴趣则采用cDNA为来源的克隆策略。如果对基因的表达调控或编码区的间隔序列感兴趣，则选择基因组DNA克隆的策略。可以通过构建基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)或cDNA文库(cDNAlibrary)来克隆目的基因。,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,*从基因组DNA文库获取目的基因,目录,目录,（三）利用分子探针筛选cDNA文库可分离特异编码序列,（二）利用核酸杂交从全基因组DNA文库中获取目的基因,与筛选基因组文库不同的是，只能用cDNA序列或基因组DNA编码序列做探针来筛选cDNA文库。如果已有分离、纯化的蛋白质，利用该抗原制备特异性抗体，也可作为分子探针用来筛选cDNA表达文库，获得已知蛋白质的cDNA克隆。,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,目录,（四）某些转录因子的编码基因可通过特异杂交系统被克隆,酵母单杂交系统用于DNA结合蛋白的基因克隆酵母双杂交系统用于特异性相互作用蛋白质的基因克隆,.,.,报告基因,报告基因,报告基因,A.无转录因子：报告基因不表达,“诱饵”DNA序列,B.有转录因子：报告基因表达,酵母单杂交系统,C.有GAL4AD/DNA结合蛋白-融合蛋白：报告基因表达,DNA结合蛋白,GAL4AD,转录因子,.,报告基因,报告基因,酵母双杂交系统,B.有相互作用的蛋白质，报告基因表达,启动子,A.无相互作用的蛋白质，报告基因不表达,“诱饵”,“猎物”,AD,BD,上游激活序列,启动子,BD,“诱饵”,“猎物”,AD,上游激活序列,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小结,重组DNA技术操作的主要步骤,目录,第四节克隆DNA的相关分析AnalysisofClonedDNA,一、通过限制性作图初步了解DNA的序列信息二、DNA测序是了解DNA序列信息最首要的工作,三、利用生物信息学技术对已测定的序列信息进行分析、综合和储存,（一）确定克隆的开放阅读框可了解编码蛋白质的信息（二）利用计算机程序确定外显子/内含子边界（三）通过数据库搜索确定启动子和转录因子结合位点（四）通过数据库搜索确定蛋白质基序和结构域（五）应用网络序列比对搜索工具进行核苷酸和/或蛋白质序列比对,四、分子杂交与印迹技术检测特异基因的存在或表达,（一）Southern印迹检测目的DNA在基因组中的存在（二）Northern印迹检测目的基因在组织的特异性表达（三）检测特异基因存在或表达还有许多其他方法,Southern印迹,目录,检测特异基因存在或表达还有许多其他方法,RNA酶保护分析也可检测基因在组织的特异性表达反转录PCR可快速检测特异基因的表达实时定量RT-PCR能定量检测特异基因的表达原位杂交能检测基因在组织和细胞中表达定位DNA微阵列分析可检测基因表达谱,标记的反义RNA,特异性mRNA,退火,双链RNA被保护,RNase,标记的反义RNA,非特异性mRNA,反义RNA不能退火,RNase,单链RNA被降解,凝胶电泳及放射自显影分析,RNA酶保护实验原理,引物1,mRNA,反转录反应,杂化双链,RNA-DNA,引物2,与引物2退火,cDNA,第一轮PCR,引物1、2重复PCR,产物,反转录PCR原理,DNA微阵列示意,第五节重组DNA技术在生物学及医学中的应用ApplicationsofRecombinantDNATechnologyinBiologyandMedicine,（一）大肠杆菌（E.coli）原核表达系统简便、经济而高效（二）很多修饰蛋白质可在真核表达系统中产生1.非整合基因在宿主细胞呈瞬时表达2.整合基因在宿主细胞呈稳定表达（三）克隆基因所编码的蛋白质也可经体外翻译而获得,一、克隆的基因可表达具有生物活性的蛋白质,标准：选择标志强启动子翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusionbody)很难表达大量可溶性蛋白,原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）,大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,目录,目录,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、不经济,转染：将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射,真核表达体系酵母、昆虫、乳类动物细胞,真核表达载体pcDNA3的物理图谱,表达载体pFASTBACI的物理图谱,（一）利用